Abstrait\nLes phosphodiestérases nucléotidiques cycliques (PDE) agissent en conjonction avec les adénylates / guanylates cyclases pour réguler les seconds messagers clés de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G. Les tentatives précédentes pour déterminer la structure intégrale des membres de la famille PDE à haute résolution ont été gênées par la flexibilité structurelle, en particulier dans leurs régions de liaison et leurs extrémités N-terminale et C-terminale. Par conséquent, la plupart des études sur les relations structure-activité se sont jusqu'ici concentrées sur les domaines catalytiques tronqués et conservés, plutôt que sur les domaines régulateurs qui régissent allostériquement l'activité de la plupart des EDP. Ici, nous avons utilisé la microscopie cryogénique à particule unique pour déterminer la structure du complexe PDE6αβ2γ de pleine longueur. La carte de densité finale résolue à 3,4 Â révèle plusieurs caractéristiques structurelles inédites, notamment un domaine N-terminal enroulé et l'interface des sous-unités PDE6γ avec l'hétérodimère PDE6αβ. La comparaison du complexe PDE6αβ2γ avec l'état fermé de PDE2A permet de mieux comprendre les changements conformationnels associés à l'activation allostérique des PDE de type I.
"},{"id":"text-2","type":"text","heading":"","plain_text":"INTRODUCTION\nLa famille des phosphodiestérases (PDE) présente un domaine de phosphohydrolase catalytique conservé, dont l’activité est contrôlée par diverses structures et mécanismes de régulation du domaine (1, 2) (fig. S1 et S2). En raison de leur association avec diverses pathologies et de leurs distributions cellulaires et subcellulaires distinctes, les PDE sont la cible de plusieurs médicaments largement utilisés et restent une cible majeure pour le développement de médicaments (3). La plupart des études sur les relations structure-activité se sont jusqu'ici concentrées sur leurs domaines catalytiques conservés qui partagent une homologie de séquence de 25 à 52% entre les membres de la famille de la PDE de type I. En conséquence, la plupart des inhibiteurs de la PDE présentent un degré substantiel de réactivité croisée au sein de la famille de la PDE (4, 5) et d’autres enzymes connexes (6). En particulier, les inhibiteurs de la PDE5, y compris le sildénafil et le vardénafil, sont largement utilisés pour le traitement de la dysfonction érectile et de l’hypertension pulmonaire (7). Cependant, les inhibiteurs de la PDE5 ont été associés à plusieurs effets secondaires oculaires, notamment une vision floue, des modifications de la vision des couleurs, des altérations transitoires de l’électrorétinogramme, une hyperhémie conjonctivale, des douleurs oculaires, une photophobie et, dans les cas extrêmes, des lésions du nerf optique (8). Ces effets secondaires sont médiés par la liaison d'inhibiteurs de la PDE5 à une phosphohydrolase étroitement apparentée, la PDE6 (9), avec environ 10% de l'effet inhibiteur comparé à la PDE5 (dix). La PDE6 est un composant essentiel de la phototransduction visuelle qui catalyse l'hydrolyse de la guanosine 3 ', 5'-monophosphate (GMPc) en GMP en réponse à la lumière (9, 11). La réduction de la concentration de GMPc entraîne la fermeture de Na+ et ca2+ canaux ioniques dans la membrane plasmique des photorécepteurs, conduisant à leur hyperpolarisation. En raison de son efficacité catalytique fonctionnant près de la limite de diffusion du GMPc et d’une activation environ 100 fois supérieure par la transducine (12), La PDE6 est cruciale pour la phototransduction visuelle. Le photorécepteur à bâtonnets PDE6 est une phosphohydrolase atypique constituée d’un noyau catalytique hétérodimère composé de sous-unités PDE6α et PDE6β (hétérodimère PDE6αβ) et de deux sous-unités inhibitrices PDE6γ (11). Tous les autres membres de la PDE de type I possèdent un noyau catalytique homodimère, y compris la PDE6 provenant de photorécepteurs à cônes, composé de deux sous-unités α '(13). Toutes les sous-unités catalytiques PDE6 contiennent deux domaines GAF réglementaires N-terminaux (GAF-A et GAF-B) et un domaine catalytique C-terminal (14). Les domaines GAF et les sous-unités PDE6γ inhibitrices étroitement liées régulent l’activité du domaine catalytique allostérique (15). La liaison du GMPc au domaine GAF-A de la PDE6 augmente l'affinité pour la sous-unité PDE6γ qui inhibe l'activité catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ lorsqu'elle est liée. Réciproquement, la liaison de PDE6γ aux sous-unités catalytiques hétérodimères de PDE6αβ augmente l’affinité du GMPc pour les sites non catalytiques, ce qui, à son tour, augmente l’affinité des domaines catalytiques pour PDE6γ (15–17). Au cours de la phototransduction, la transducine activée[Gα[Gα[Gα[Gαt-GTP (guanosine 5′-triphosphate)]réduit la contrainte inhibitrice de la région C-terminale de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16), entraînant une affinité de liaison réduite du GMPc à l’un des deux domaines de GAF-A et la libération de GMPc. Gαt-GTP s'est déjà montré capable de se lier aux résidus d'aminoacides 24 à 45 (18–21), 54 à 55 (22) et 55 à 62 (22) et l'extrémité C de PDE6γ (23). Parmi ces sites d’interaction, la région riche en glycine de PDE6γ (résidus 55 à 62) a été impliquée dans la facilitation de l’interaction de Gα.t-GTP avec la région polycationique N-terminale de PDE6γ (18–22).\nL'absence d'une compréhension détaillée de la modulation allostérique des isoenzymes de la PDE a limité le succès commercial des inhibiteurs de la PDE en raison de la réactivité croisée au sein de la famille des PDE. Plusieurs structures à haute résolution de domaines individuels d'isoenzymes PDE, notamment PDE1, PDE2, PDE3, PDE4, PDE5, PDE6, PDE7, PDE8, PDE9 et PDE10, sont disponibles (figure S1). Une structure cristalline de PDE2A presque complète comprenant à la fois des domaines GAF et catalytique a été rapportée précédemment (24). En outre, plusieurs structures de microscopie cryo – électronique à faible résolution (PDC6) décrivant l’architecture globale de l’isoenzyme ont été rapportées (14, 25, 26). Malgré la richesse des connaissances fournies par ces structures partielles, les relations structurelles entre les domaines de la réglementation et le domaine catalytique des membres de la famille des PDE restent floues.","html":"INTRODUCTION\nLa famille des phosphodiestérases (PDE) présente un domaine de phosphohydrolase catalytique conservé, dont l’activité est contrôlée par diverses structures et mécanismes de régulation du domaine (1, 2) (fig. S1 et S2). En raison de leur association avec diverses pathologies et de leurs distributions cellulaires et subcellulaires distinctes, les PDE sont la cible de plusieurs médicaments largement utilisés et restent une cible majeure pour le développement de médicaments (3). La plupart des études sur les relations structure-activité se sont jusqu'ici concentrées sur leurs domaines catalytiques conservés qui partagent une homologie de séquence de 25 à 52% entre les membres de la famille de la PDE de type I. En conséquence, la plupart des inhibiteurs de la PDE présentent un degré substantiel de réactivité croisée au sein de la famille de la PDE (4, 5) et d’autres enzymes connexes (6). En particulier, les inhibiteurs de la PDE5, y compris le sildénafil et le vardénafil, sont largement utilisés pour le traitement de la dysfonction érectile et de l’hypertension pulmonaire (7). Cependant, les inhibiteurs de la PDE5 ont été associés à plusieurs effets secondaires oculaires, notamment une vision floue, des modifications de la vision des couleurs, des altérations transitoires de l’électrorétinogramme, une hyperhémie conjonctivale, des douleurs oculaires, une photophobie et, dans les cas extrêmes, des lésions du nerf optique (8). Ces effets secondaires sont médiés par la liaison d'inhibiteurs de la PDE5 à une phosphohydrolase étroitement apparentée, la PDE6 (9), avec environ 10% de l'effet inhibiteur comparé à la PDE5 (dix). La PDE6 est un composant essentiel de la phototransduction visuelle qui catalyse l'hydrolyse de la guanosine 3 ', 5'-monophosphate (GMPc) en GMP en réponse à la lumière (9, 11). La réduction de la concentration de GMPc entraîne la fermeture de Na+ et ca2+ canaux ioniques dans la membrane plasmique des photorécepteurs, conduisant à leur hyperpolarisation. En raison de son efficacité catalytique fonctionnant près de la limite de diffusion du GMPc et d’une activation environ 100 fois supérieure par la transducine (12), La PDE6 est cruciale pour la phototransduction visuelle. Le photorécepteur à bâtonnets PDE6 est une phosphohydrolase atypique constituée d’un noyau catalytique hétérodimère composé de sous-unités PDE6α et PDE6β (hétérodimère PDE6αβ) et de deux sous-unités inhibitrices PDE6γ (11). Tous les autres membres de la PDE de type I possèdent un noyau catalytique homodimère, y compris la PDE6 provenant de photorécepteurs à cônes, composé de deux sous-unités α '(13). Toutes les sous-unités catalytiques PDE6 contiennent deux domaines GAF réglementaires N-terminaux (GAF-A et GAF-B) et un domaine catalytique C-terminal (14). Les domaines GAF et les sous-unités PDE6γ inhibitrices étroitement liées régulent l’activité du domaine catalytique allostérique (15). La liaison du GMPc au domaine GAF-A de la PDE6 augmente l'affinité pour la sous-unité PDE6γ qui inhibe l'activité catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ lorsqu'elle est liée. Réciproquement, la liaison de PDE6γ aux sous-unités catalytiques hétérodimères de PDE6αβ augmente l’affinité du GMPc pour les sites non catalytiques, ce qui, à son tour, augmente l’affinité des domaines catalytiques pour PDE6γ (15–17). Au cours de la phototransduction, la transducine activée[Gα[Gα[Gα[Gαt-GTP (guanosine 5′-triphosphate)]réduit la contrainte inhibitrice de la région C-terminale de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16), entraînant une affinité de liaison réduite du GMPc à l’un des deux domaines de GAF-A et la libération de GMPc. Gαt-GTP s'est déjà montré capable de se lier aux résidus d'aminoacides 24 à 45 (18–21), 54 à 55 (22) et 55 à 62 (22) et l'extrémité C de PDE6γ (23). Parmi ces sites d’interaction, la région riche en glycine de PDE6γ (résidus 55 à 62) a été impliquée dans la facilitation de l’interaction de Gα.t-GTP avec la région polycationique N-terminale de PDE6γ (18–22).\nL'absence d'une compréhension détaillée de la modulation allostérique des isoenzymes de la PDE a limité le succès commercial des inhibiteurs de la PDE en raison de la réactivité croisée au sein de la famille des PDE. Plusieurs structures à haute résolution de domaines individuels d'isoenzymes PDE, notamment PDE1, PDE2, PDE3, PDE4, PDE5, PDE6, PDE7, PDE8, PDE9 et PDE10, sont disponibles (figure S1). Une structure cristalline de PDE2A presque complète comprenant à la fois des domaines GAF et catalytique a été rapportée précédemment (24). En outre, plusieurs structures de microscopie cryo – électronique à faible résolution (PDC6) décrivant l’architecture globale de l’isoenzyme ont été rapportées (14, 25, 26). Malgré la richesse des connaissances fournies par ces structures partielles, les relations structurelles entre les domaines de la réglementation et le domaine catalytique des membres de la famille des PDE restent floues.
"},{"id":"text-3","type":"text","heading":"","plain_text":"RÉSULTATS\nPour obtenir des informations structurelles sur ce mécanisme allostérique, nous avons purifié la PDE6 bovine native à partir de segments extérieurs de tige (ROS) et avons utilisé la cryo-EM pour déterminer la structure du complexe PDE6αβ2γ. La structure du complexe PDE6αβ2γ résolue à une résolution de 3,4 Å montre une organisation linéaire des trois domaines (GAF-A, GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase) reliés par des hélices α longues dans les sous-unités PDE6α et PDE6β (Fig. . 1). La structure globale de PDE6 montre une architecture trilobée avec chaque lobe correspondant aux domaines catalytiques GAF-A, GAF-B et phosphohydrolase de l'hétérodimère PDE6αβ (figures 1 et 2, A et D). L'hétérodimère PDE6αβ atteint une pseudo-symétrie double où les trois domaines de PDE6α et PDE6β sont organisés dans un arrangement tête à tête avec une dimension de 154 Å, de 115 Å et de 74 Å. L’interface hétérodimérique de l’hétérodimère PDE6αβ (~ 5036 Å2) s'étend sur toute la longueur de la molécule. Les principales interfaces se situent dans la structure hélicoïdale à queue de cheval N-terminal (motif Pt, ~ 895 Å2) et des hélices de liaison étendues reliant GAF-A à GAF-B (LH1; ~ 510 Å2) et GAF-B dans le domaine catalytique (LH2; ~ 685 Å2) de PDE6α et PDE6β. L'analyse de résolution locale de l'hétérodimère PDE6αβ montre une résolution meilleure que 3,4Å dans le noyau et 5 à 7Å dans les régions périphériques (figure 1A, en bas). Le motif Pt fait partie des régions les plus flexibles du complexe PDE6αβ2γ avec une résolution locale de 7 à 8 Å (Fig. 1A, en bas) et présente donc une incertitude dans le modèle de novo. Le modèle final est composé des résidus d'acides aminés 10 à 822 de PDE6α et de 11 à 822 de PDE6β (Fig. 1C). Les résidus d'acides aminés 2 à 9 et 823 à 856 de PDE6α ainsi que 2 à 10 et 823 à 850 de PDE6β n'ont pas pu être modélisés en raison de leur flexibilité. Cette flexibilité est illustrée par les moyennes de classe bidimensionnelle (2D) qui montrent un flou des extrémités C-terminales flexibles des PDE6α et PDE6β (fig. S3D, flèches). Ces longs hélices C-terminales s'étendent dans des directions opposées et servent de sites pour les modifications lipidiques qui ancrent la PDE6αβ2γ dans les membranes des disques ROS. Bien que la moyenne des hélices C-terminales de l'hétérodimère PDE6αβ ait été moyennée lors de la reconstruction cryo-EM 3D finale, il s'agit du premier exemple dans lequel des instantanés 2D de ces longs hélices C-terminaux ont été visualisés.","html":"RÉSULTATS\nPour obtenir des informations structurelles sur ce mécanisme allostérique, nous avons purifié la PDE6 bovine native à partir de segments extérieurs de tige (ROS) et avons utilisé la cryo-EM pour déterminer la structure du complexe PDE6αβ2γ. La structure du complexe PDE6αβ2γ résolue à une résolution de 3,4 Å montre une organisation linéaire des trois domaines (GAF-A, GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase) reliés par des hélices α longues dans les sous-unités PDE6α et PDE6β (Fig. . 1). La structure globale de PDE6 montre une architecture trilobée avec chaque lobe correspondant aux domaines catalytiques GAF-A, GAF-B et phosphohydrolase de l'hétérodimère PDE6αβ (figures 1 et 2, A et D). L'hétérodimère PDE6αβ atteint une pseudo-symétrie double où les trois domaines de PDE6α et PDE6β sont organisés dans un arrangement tête à tête avec une dimension de 154 Å, de 115 Å et de 74 Å. L’interface hétérodimérique de l’hétérodimère PDE6αβ (~ 5036 Å2) s'étend sur toute la longueur de la molécule. Les principales interfaces se situent dans la structure hélicoïdale à queue de cheval N-terminal (motif Pt, ~ 895 Å2) et des hélices de liaison étendues reliant GAF-A à GAF-B (LH1; ~ 510 Å2) et GAF-B dans le domaine catalytique (LH2; ~ 685 Å2) de PDE6α et PDE6β. L'analyse de résolution locale de l'hétérodimère PDE6αβ montre une résolution meilleure que 3,4Å dans le noyau et 5 à 7Å dans les régions périphériques (figure 1A, en bas). Le motif Pt fait partie des régions les plus flexibles du complexe PDE6αβ2γ avec une résolution locale de 7 à 8 Å (Fig. 1A, en bas) et présente donc une incertitude dans le modèle de novo. Le modèle final est composé des résidus d'acides aminés 10 à 822 de PDE6α et de 11 à 822 de PDE6β (Fig. 1C). Les résidus d'acides aminés 2 à 9 et 823 à 856 de PDE6α ainsi que 2 à 10 et 823 à 850 de PDE6β n'ont pas pu être modélisés en raison de leur flexibilité. Cette flexibilité est illustrée par les moyennes de classe bidimensionnelle (2D) qui montrent un flou des extrémités C-terminales flexibles des PDE6α et PDE6β (fig. S3D, flèches). Ces longs hélices C-terminales s'étendent dans des directions opposées et servent de sites pour les modifications lipidiques qui ancrent la PDE6αβ2γ dans les membranes des disques ROS. Bien que la moyenne des hélices C-terminales de l'hétérodimère PDE6αβ ait été moyennée lors de la reconstruction cryo-EM 3D finale, il s'agit du premier exemple dans lequel des instantanés 2D de ces longs hélices C-terminaux ont été visualisés.
"},{"id":"text-4","type":"text","heading":"","plain_text":"Fig. 1 La structure cryo-EM du complexe ternaire PDE6αβ2γ à une résolution de 3,4 Å.\n(UNE) Reconstruction 3D cryo-EM globale du complexe PDE6αβ2γ affichant le domaine de queue de cheval N-terminal de 34 Å de long (motif Pt) (en haut) et la carte d’estimation de la résolution locale (en bas). Les touches de résolution sont étiquetées de 3.2 (bleu) à 8.0 Å (rouge). (B) Quatre vues orthogonales de la structure cryo-EM du complexe PDE6αβ2γ affichant PDE6α (violet), PDE6β (cyan vert) et deux molécules de sous-unités PDE6γ (rouge). (C) Structures de PDE6α (en haut, 10 à 822) et de PDE6β (en bas, 11 à 822) dans deux vues orthogonales représentées en dessin animé. Barre d'échelle, 30 Å.","html":"Fig. 1 La structure cryo-EM du complexe ternaire PDE6αβ2γ à une résolution de 3,4 Å.\n(UNE) Reconstruction 3D cryo-EM globale du complexe PDE6αβ2γ affichant le domaine de queue de cheval N-terminal de 34 Å de long (motif Pt) (en haut) et la carte d’estimation de la résolution locale (en bas). Les touches de résolution sont étiquetées de 3.2 (bleu) à 8.0 Å (rouge). (B) Quatre vues orthogonales de la structure cryo-EM du complexe PDE6αβ2γ affichant PDE6α (violet), PDE6β (cyan vert) et deux molécules de sous-unités PDE6γ (rouge). (C) Structures de PDE6α (en haut, 10 à 822) et de PDE6β (en bas, 11 à 822) dans deux vues orthogonales représentées en dessin animé. Barre d'échelle, 30 Å.
"},{"id":"text-5","type":"text","heading":"","plain_text":"Fig. 2 Caractéristiques structurelles du complexe PDE6αβ2γ.\n(UNE) Structure de l'hétérodimère PDE6αβ montrant la distribution du domaine dans les sous-unités PDE6α (violet) et PDE6β (cyan vert) où les domaines régulateurs GAF sont suivis par le domaine catalytique de la phosphohydrolase dans une organisation trilobée. Une molécule de PDE6γ (ruban rouge) enveloppe individuellement PDE6α et PDE6β pour une régulation plus précise de l'activité de la PDE6. Une molécule de GMPc (sphères rouges) est liée à chacun des domaines GAF-A de l'hétérodimère PDE6αβ. (B) Vue agrandie de la poche de liaison du GMP-GAF-A montrant l’orientation de la molécule du GMPc (bâtons rouges) par rapport aux structures secondaires environnantes. La densité électronique correspondant à la molécule de GMPc a été calculée après le raffinement final et est affichée en gris. (C) Les domaines GAF-A liés au cGMP du complexe PDE6αβ2γ (à gauche) et de PDE6C (en gris, à droite) présentent un pont de sel entre la charge négative partielle de Asn114 carbonyl oxygène et le groupe guanidine de Arg93. Résidu d'acide aminé Asn114 fournit d'importantes liaisons hydrogène protéine-ligand spécifiques du GMPc qui stabilisent la liaison du GMPc. (ré) Schéma de topologie montrant les éléments de structure secondaires du motif Pt (gris), GAF-A (rouge), GAF-B (violet) et du domaine catalytique (vert). (E) Vue agrandie de la poche de liaison au cGMP (maille rouge) du domaine PDE6α GAF-A. L'extrémité N de PDE6γ (bande dessinée rouge) forme un couvercle sur la molécule de GMPc enterrée et empêche ainsi sa libération du domaine GAF-A jusqu'à ce qu'un gradient de concentration seuil de GMPc soit atteint dans la cellule. La densité électronique de l'extrémité N-terminale de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (F) Interface d’interaction entre la boucle GAF-A β1-β2 et le domaine GAF-B de PDE6α. PDE6γ (en rouge) agrafe l'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 avec le domaine GAF-B et détecte probablement les modifications associées à la liaison du GMPc dans le domaine GAF-A. La densité électronique affinée autour de la boucle GAF-A β1-β2 est affichée en gris. (g) L’interface entre la boucle GAF-B β1-β2 de PDE6α et le domaine catalytique de PDE6β présente une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique. La densité électronique affinée correspondant aux principaux résidus d’acides aminés est affichée en gris.","html":"Fig. 2 Caractéristiques structurelles du complexe PDE6αβ2γ.\n(UNE) Structure de l'hétérodimère PDE6αβ montrant la distribution du domaine dans les sous-unités PDE6α (violet) et PDE6β (cyan vert) où les domaines régulateurs GAF sont suivis par le domaine catalytique de la phosphohydrolase dans une organisation trilobée. Une molécule de PDE6γ (ruban rouge) enveloppe individuellement PDE6α et PDE6β pour une régulation plus précise de l'activité de la PDE6. Une molécule de GMPc (sphères rouges) est liée à chacun des domaines GAF-A de l'hétérodimère PDE6αβ. (B) Vue agrandie de la poche de liaison du GMP-GAF-A montrant l’orientation de la molécule du GMPc (bâtons rouges) par rapport aux structures secondaires environnantes. La densité électronique correspondant à la molécule de GMPc a été calculée après le raffinement final et est affichée en gris. (C) Les domaines GAF-A liés au cGMP du complexe PDE6αβ2γ (à gauche) et de PDE6C (en gris, à droite) présentent un pont de sel entre la charge négative partielle de Asn114 carbonyl oxygène et le groupe guanidine de Arg93. Résidu d'acide aminé Asn114 fournit d'importantes liaisons hydrogène protéine-ligand spécifiques du GMPc qui stabilisent la liaison du GMPc. (ré) Schéma de topologie montrant les éléments de structure secondaires du motif Pt (gris), GAF-A (rouge), GAF-B (violet) et du domaine catalytique (vert). (E) Vue agrandie de la poche de liaison au cGMP (maille rouge) du domaine PDE6α GAF-A. L'extrémité N de PDE6γ (bande dessinée rouge) forme un couvercle sur la molécule de GMPc enterrée et empêche ainsi sa libération du domaine GAF-A jusqu'à ce qu'un gradient de concentration seuil de GMPc soit atteint dans la cellule. La densité électronique de l'extrémité N-terminale de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (F) Interface d’interaction entre la boucle GAF-A β1-β2 et le domaine GAF-B de PDE6α. PDE6γ (en rouge) agrafe l'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 avec le domaine GAF-B et détecte probablement les modifications associées à la liaison du GMPc dans le domaine GAF-A. La densité électronique affinée autour de la boucle GAF-A β1-β2 est affichée en gris. (g) L’interface entre la boucle GAF-B β1-β2 de PDE6α et le domaine catalytique de PDE6β présente une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique. La densité électronique affinée correspondant aux principaux résidus d’acides aminés est affichée en gris.
"},{"id":"text-6","type":"text","heading":"","plain_text":"La région N-terminale de l'hétérodimère PDE6αβ présente un motif Pt asymétrique à double brin qui s'étend sur plus de 34 Å de long (figure 1). Le motif Pt fournit probablement une stabilité structurelle à l'hétérodimère PDE6αβ en fournissant une interface d'interaction de ~ 895 Å2 entre les sous-unités PDE6α et PDE6β. L'asymétrie du motif Pt peut être attribuée à la faible identité de séquence entre les régions N-terminales des deux sous-unités de l'hétérodimère PDE6αβ, avec 27% d'identité dans les 70 premiers acides aminés, par rapport à 77,5% d'identité dans le reste de la séquence. (fig. S2). Le domaine GAF-A de l’hétérodimère PDE6αβ présente une similarité structurelle élevée avec les domaines GAF-A précédemment publiés de PDE2A (24), PDE5 (27) et PDE6C (28) avec des déviations quadratiques moyennes de 1,34, 1,17 et 1,12 Å, respectivement. Les caractéristiques structurelles conservées du domaine GAF-A comprennent un groupe de feuilles β antiparallèles avec un ordre de brins 3-2-1-6-5-4 (Fig. 2D et fig. S4A). Ce groupe de feuilles β est pris en sandwich par les hélices α1, α2 et α5 qui se trouvent vers l'interface hétérodimère, ainsi que par les hélices α3 et α4 du côté distal (Fig. 2A et fig. S4A). En comparaison avec les structures précédemment déterminées des domaines GAF-A, un changement structurel substantiel est observé dans la boucle longue de 14 acides aminés qui relie le β1 au brin β2 (boucle β1-β2) du gène β à six brins de GAF-A. -groupe de feuilles. La boucle β1-β2 de GAF-A interagit directement avec le brin β4 et la boucle β6-α5 du domaine régulateur de GAF-B, suggérant une voie potentielle de transduction du signal allostérique du domaine GAF-A au domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP (Fig. 2F).\nLa carte affinée de cryo-EM montre une molécule de GMPc liée au domaine GAF-A de PDE6α et de PDE6β (figures 2, A, B et 3A). Le groupe phosphate 3 ', 5'-cyclique du GMPc pointe vers les hélices α3 et α4, alors que son cycle guanine établit plusieurs contacts bien définis avec les brins β1 et β2 (Fig. 2B et fig. S4C). La molécule cGMP enterrée établit plusieurs contacts électrostatiques avec les chaînes latérales de Ser95, Asn114, Val166et Thr174 en plus des contacts hydrophobes avec Phe113, Phe134, Val140, Tyr172et M193 qui déterminent son orientation dans la poche de liaison du cGMP (Fig. 2B et fig. S4C). Comme observé dans la structure cristalline du domaine PDE6C GAF-A lié au cGMP (28), le domaine GAF-A de PDE6αβ2γ contient Asn114 bloqué en position par un pont de sel 3,0 Å entre la charge partiellement négative de son oxygène carbonyle et le groupe guanidine de Arg93 (Fig. 2C). La région polycationique N-terminale de PDE6γ se lie à proximité du site de liaison au GMPc de GAF-A, suggérant son rôle potentiel dans la prévention de la libération de GMPc lié à moins qu'un certain seuil de gradient de GMPc ne soit établi dans la cellule, abaissant ainsi la constante de dissociation. (Kré) de GMPc pour le domaine GAF-A (Fig. 2E et 3A). De plus, PDE6γ agrafe le site d'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 au domaine GAF-B et détecte probablement les changements lors de la liaison du GMPc (figures 2, A et F et 3A). Une molécule de PDE6γ interagit exclusivement avec GAF-A et le domaine catalytique de la même sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ, suggérant une régulation allostérique plus étroite (Figs. 1B, 2A et 3A). Les sous-unités PDE6γ affichent une plage de résolution de 3,2 à 9 Å avec la résolution la plus élevée atteinte aux extrémités N et C-terminales en raison de leur interaction directe avec GAF-A et les domaines catalytiques, respectivement (figures 2, A, E et F). et 3, A et B). Les résidus d'acides aminés 30 à 70 de PDE6γ ont été omis du modèle de novo final du complexe PDE6αβ2γ en raison de la faible densité de cryo-EM près de cette région (Fig. 3, A et B). Cela pourrait s'expliquer par la nature flexible du segment polypeptidique et par l'absence de contacts d'interface directs avec l'hétérodimère PDE6αβ. Globalement, ces résultats suggèrent une communication directe entre les domaines régulateurs GAF-A et GAF-B liés au GMPc dans le complexe PDE6αβ2γ à travers la boucle β1-β2 de GAF-A.","html":"La région N-terminale de l'hétérodimère PDE6αβ présente un motif Pt asymétrique à double brin qui s'étend sur plus de 34 Å de long (figure 1). Le motif Pt fournit probablement une stabilité structurelle à l'hétérodimère PDE6αβ en fournissant une interface d'interaction de ~ 895 Å2 entre les sous-unités PDE6α et PDE6β. L'asymétrie du motif Pt peut être attribuée à la faible identité de séquence entre les régions N-terminales des deux sous-unités de l'hétérodimère PDE6αβ, avec 27% d'identité dans les 70 premiers acides aminés, par rapport à 77,5% d'identité dans le reste de la séquence. (fig. S2). Le domaine GAF-A de l’hétérodimère PDE6αβ présente une similarité structurelle élevée avec les domaines GAF-A précédemment publiés de PDE2A (24), PDE5 (27) et PDE6C (28) avec des déviations quadratiques moyennes de 1,34, 1,17 et 1,12 Å, respectivement. Les caractéristiques structurelles conservées du domaine GAF-A comprennent un groupe de feuilles β antiparallèles avec un ordre de brins 3-2-1-6-5-4 (Fig. 2D et fig. S4A). Ce groupe de feuilles β est pris en sandwich par les hélices α1, α2 et α5 qui se trouvent vers l'interface hétérodimère, ainsi que par les hélices α3 et α4 du côté distal (Fig. 2A et fig. S4A). En comparaison avec les structures précédemment déterminées des domaines GAF-A, un changement structurel substantiel est observé dans la boucle longue de 14 acides aminés qui relie le β1 au brin β2 (boucle β1-β2) du gène β à six brins de GAF-A. -groupe de feuilles. La boucle β1-β2 de GAF-A interagit directement avec le brin β4 et la boucle β6-α5 du domaine régulateur de GAF-B, suggérant une voie potentielle de transduction du signal allostérique du domaine GAF-A au domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP (Fig. 2F).\nLa carte affinée de cryo-EM montre une molécule de GMPc liée au domaine GAF-A de PDE6α et de PDE6β (figures 2, A, B et 3A). Le groupe phosphate 3 ', 5'-cyclique du GMPc pointe vers les hélices α3 et α4, alors que son cycle guanine établit plusieurs contacts bien définis avec les brins β1 et β2 (Fig. 2B et fig. S4C). La molécule cGMP enterrée établit plusieurs contacts électrostatiques avec les chaînes latérales de Ser95, Asn114, Val166et Thr174 en plus des contacts hydrophobes avec Phe113, Phe134, Val140, Tyr172et M193 qui déterminent son orientation dans la poche de liaison du cGMP (Fig. 2B et fig. S4C). Comme observé dans la structure cristalline du domaine PDE6C GAF-A lié au cGMP (28), le domaine GAF-A de PDE6αβ2γ contient Asn114 bloqué en position par un pont de sel 3,0 Å entre la charge partiellement négative de son oxygène carbonyle et le groupe guanidine de Arg93 (Fig. 2C). La région polycationique N-terminale de PDE6γ se lie à proximité du site de liaison au GMPc de GAF-A, suggérant son rôle potentiel dans la prévention de la libération de GMPc lié à moins qu'un certain seuil de gradient de GMPc ne soit établi dans la cellule, abaissant ainsi la constante de dissociation. (Kré) de GMPc pour le domaine GAF-A (Fig. 2E et 3A). De plus, PDE6γ agrafe le site d'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 au domaine GAF-B et détecte probablement les changements lors de la liaison du GMPc (figures 2, A et F et 3A). Une molécule de PDE6γ interagit exclusivement avec GAF-A et le domaine catalytique de la même sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ, suggérant une régulation allostérique plus étroite (Figs. 1B, 2A et 3A). Les sous-unités PDE6γ affichent une plage de résolution de 3,2 à 9 Å avec la résolution la plus élevée atteinte aux extrémités N et C-terminales en raison de leur interaction directe avec GAF-A et les domaines catalytiques, respectivement (figures 2, A, E et F). et 3, A et B). Les résidus d'acides aminés 30 à 70 de PDE6γ ont été omis du modèle de novo final du complexe PDE6αβ2γ en raison de la faible densité de cryo-EM près de cette région (Fig. 3, A et B). Cela pourrait s'expliquer par la nature flexible du segment polypeptidique et par l'absence de contacts d'interface directs avec l'hétérodimère PDE6αβ. Globalement, ces résultats suggèrent une communication directe entre les domaines régulateurs GAF-A et GAF-B liés au GMPc dans le complexe PDE6αβ2γ à travers la boucle β1-β2 de GAF-A.
"},{"id":"text-7","type":"text","heading":"","plain_text":"Fig. 3 La sous-unité PDE6γ stabilise la conformation à l'état ouvert de l'hétérodimère PDE6αβ.\n(UNE) Densité Cryo-EM (modèle gauche, surface rouge) et modèle de novo partiel (ruban rouge) de PDE6γ autour de l'hétérodimère PDE6αβ (PDE6α, violet; PDE6β, cyan vert). Une molécule de PDE6γ entoure PDE6α et PDE6β individuellement pour une régulation plus stricte de l’activité de la PDE6. (B) Carte d'estimation de résolution locale (à gauche) et modèle de novo partiel (à droite) de PDE6γ montrant une bonne corrélation entre la carte 3D et le modèle PDE6γ affiné. La densité de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (C) Comparaison entre les domaines catalytiques de PDE6α (violet), PDE2A à état fermé (rose, PDBID: 3IBJ) et PDE2A lié à l’inhibiteur (orange, PDB ID: 4D08) affichant différentes orientations de la boucle en H (606 à 629, gauche) et de la boucle M (745 à 767, à droite). Le domaine catalytique de PDE2A à l'état fermé montre la boucle en H repliée dans le site catalytique à proximité de la poche de liaison au substrat (maille noire). En revanche, le domaine catalytique de PDE6α présente une boucle H ouverte similaire à la structure cristalline de PDE2A liée à l'inhibiteur. La région M-loop de PDE6α (violet) présente une conformation similaire à celle de la structure PDE2A liée à l'inhibiteur (orange). Notamment, les résidus 840 à 850 de la boucle M de la structure cristalline de PDE2A à l'état fermé (rose) sont désordonnés. (ré) L’extrémité C de la PDE6γ (bande rouge) se lie près de la poche de liaison au substrat du domaine catalytique de la PDE6. La liaison de PDE6y au domaine catalytique de PDE6 imite une forme liée à un substrat / inhibiteur dans laquelle la boucle en H présente une conformation ouverte et la poche de liaison au substrat est bouchée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ. Les régions structurellement conservées du domaine catalytique (RMSD ≤ 0,2 Å entre PDE6α et PDE2A) sont indiquées en gris.","html":"Fig. 3 La sous-unité PDE6γ stabilise la conformation à l'état ouvert de l'hétérodimère PDE6αβ.\n(UNE) Densité Cryo-EM (modèle gauche, surface rouge) et modèle de novo partiel (ruban rouge) de PDE6γ autour de l'hétérodimère PDE6αβ (PDE6α, violet; PDE6β, cyan vert). Une molécule de PDE6γ entoure PDE6α et PDE6β individuellement pour une régulation plus stricte de l’activité de la PDE6. (B) Carte d'estimation de résolution locale (à gauche) et modèle de novo partiel (à droite) de PDE6γ montrant une bonne corrélation entre la carte 3D et le modèle PDE6γ affiné. La densité de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (C) Comparaison entre les domaines catalytiques de PDE6α (violet), PDE2A à état fermé (rose, PDBID: 3IBJ) et PDE2A lié à l’inhibiteur (orange, PDB ID: 4D08) affichant différentes orientations de la boucle en H (606 à 629, gauche) et de la boucle M (745 à 767, à droite). Le domaine catalytique de PDE2A à l'état fermé montre la boucle en H repliée dans le site catalytique à proximité de la poche de liaison au substrat (maille noire). En revanche, le domaine catalytique de PDE6α présente une boucle H ouverte similaire à la structure cristalline de PDE2A liée à l'inhibiteur. La région M-loop de PDE6α (violet) présente une conformation similaire à celle de la structure PDE2A liée à l'inhibiteur (orange). Notamment, les résidus 840 à 850 de la boucle M de la structure cristalline de PDE2A à l'état fermé (rose) sont désordonnés. (ré) L’extrémité C de la PDE6γ (bande rouge) se lie près de la poche de liaison au substrat du domaine catalytique de la PDE6. La liaison de PDE6y au domaine catalytique de PDE6 imite une forme liée à un substrat / inhibiteur dans laquelle la boucle en H présente une conformation ouverte et la poche de liaison au substrat est bouchée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ. Les régions structurellement conservées du domaine catalytique (RMSD ≤ 0,2 Å entre PDE6α et PDE2A) sont indiquées en gris.
"},{"id":"text-8","type":"text","heading":"","plain_text":"L'hélice α5 C-terminal de GAF-A (206 à 232) est liée à l'hélice α1 de N-terminal de GAF-B (254 à 280) par LH1 (figures 1C et 2D). Bien que le domaine GAF-B conserve une topologie familière à celle des structures de domaine de PDE2A précédemment publiées du domaine GAF-B (RMSD = 1.120 Å entre 59 paires d’atomes élaguées) (24) et PDE5 (RMSD = 1.06 Å entre 56 paires d’atomes élagués) (27), des différences structurelles substantielles ont été observées dans l’orientation de LH1 (~ 20 ° d’inclinaison), α2 (~ 10 ° d’inclinaison) et LH2 (~ 30 ° d’inclinaison). Une différence structurelle majeure a été observée dans la boucle β1-β2 longue de 34 acides aminés (280 à 313) qui relie β1 à β2 dans le groupe de feuilles β à six brins du domaine GAF-B (Fig. 2D et fig. S4B). La boucle GAF-B β1-β2 d'une sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ interagit directement avec le domaine catalytique de l'autre sous-unité (figure 2G). Cette interférence est médiée par l'architecture entrelacée de l'hétérodimère PDE6αβ, où les hélices LH2 se croisent sur le pseudo-double axe, de sorte que le domaine catalytique d'une sous-unité se trouve directement sous le domaine GAF-B de l'autre sous-unité de l'hétérodimère (Fig. 1, B et C et 2A). La région d'interaction de la boucle GAF-B β1-β2 adopte une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique (figure 2G). L'interaction directe suggère une voie potentielle de transduction du signal allostérique du GAF-A lié au GMPc au domaine catalytique via le GAF-B. Cette caractéristique fait du complexe PDE6αβ2γ la seule isoenzyme PDE montrant la deuxième association directe entre le domaine GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase, en plus de l’hélice LH2 qui relie les deux domaines. Cette découverte suggère un rôle de la boucle β1-β2 de GAF-B dans la régulation directe des domaines catalytiques de la PDE6, en convertissant le signal allostérique des domaines liés à la GAF-A liés au GMPc aux domaines catalytiques.\nL'hélice α5 C-terminal de GAF-B (414 à 441) est liée à l'hélice α-N du terminal du domaine catalytique (558 à 577) par l'intermédiaire de l'hélice LH2 et d'une région à hélice boucle-hélice comprenant un faisceau à quatre hélices. (Figures 1C et 2, A et D). La structure tout-α-hélicoïdale du domaine catalytique dans la PDE6 (PDE6a, 558 à 799; PDE6β, 556 à 796) est structurellement conservée avec les structures cristallines publiées antérieurement des domaines catalytiques de plusieurs isoenzymes de la PDE (24, 29). Cependant, un changement de conformation substantiel a été observé dans la région de la boucle H (606 à 629) qui borde le site de liaison au substrat (Fig. 3C). La boucle en H est une boucle caractéristique qui change de conformation lors de la liaison du ligand. Pendant l'activation de PDE2A, la boucle H bascule et atteint une conformation en boucle ouverte qui permet la liaison d'un substrat ou d'un inhibiteur au domaine catalytique de la PDE (Fig. 3C) (Figure 3C).24). Alors que pendant l'inactivation de PDE2A, la boucle en H ferme la poche de liaison au substrat, ce qui entraîne la désactivation de l'isoenzyme (Fig. 3C) (Fig. 3C) (24). Contrairement à la structure de PDE2A à état fermé, la boucle H du complexe PDE6αβ2γ présente une conformation ouverte rappelant l’état lié au substrat / inhibiteur des domaines catalytiques PDE2A et PDE5 (Fig. 3, C et D, et fig. 3). S5). Cette conformation en boucle H ouverte est stabilisée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ qui se lie à proximité du site de liaison au substrat et ferme la liaison au substrat (figure 3D).\nContrairement à la structure à l'état fermé de l'homodimère PDE2A, la région de boucle M (745 à 767) qui connecte a14 et a15 du domaine catalytique ne participe pas à la formation d'hétérodimère dans le complexe PDE6αβ2γ (figure 4A). À la lumière de l'interaction directe des boucles GAF β1-β2 reliant le GAF-A régulateur lié au cGMP au domaine catalytique à travers le domaine GAF-B du complexe PDE62αβγ et la comparaison avec l'état fermé de PDE2A (figure 4A) (Figure 4A).24), on peut en déduire un modèle d’activation allostérique des isoenzymes de la PDE afin de révéler les modifications conformationnelles représentatives (Fig. 4B). Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° de LH1 vers l’intérieur, une rotation de 80 ° vers l’extérieur de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° des domaines catalytiques ( Fig. 4A). Cependant, le réarrangement des domaines catalytiques est peu probable lors de l'activation allostérique de la PDE6 en raison de son association avec la PDE6γ. Pour tenter de visualiser certains de ces changements structurels, nous avons effectué une cryo-EM sur le complexe PDE6αβ2γ en présence d'un excès molaire de sildénafil cinq fois supérieur. Les moyennes des classes 2D à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ traité au sildénafil montrent une densité réduite de la boucle GAF-B β1-β2 associée à sa flexibilité accrue (Fig. 4C; comparez les panneaux marqués d'un astérisque). Les changements structurels observés concordent avec une occupation partielle du sildénafil dans le site catalytique du complexe PDE6αβ2γ en raison d’une compétition avec la sous-unité inhibitrice de PDE6γ pour le même site de liaison (30). Notamment, les domaines catalytiques n'ont pas montré de changements structurels notables, probablement à cause de la PDE6γ partiellement liée qui stabilise le complexe PDE6αβ2γ dans son état ouvert. Globalement, ces résultats confirment le rôle des boucles GAF β1-β2 dans la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE.","html":"L'hélice α5 C-terminal de GAF-A (206 à 232) est liée à l'hélice α1 de N-terminal de GAF-B (254 à 280) par LH1 (figures 1C et 2D). Bien que le domaine GAF-B conserve une topologie familière à celle des structures de domaine de PDE2A précédemment publiées du domaine GAF-B (RMSD = 1.120 Å entre 59 paires d’atomes élaguées) (24) et PDE5 (RMSD = 1.06 Å entre 56 paires d’atomes élagués) (27), des différences structurelles substantielles ont été observées dans l’orientation de LH1 (~ 20 ° d’inclinaison), α2 (~ 10 ° d’inclinaison) et LH2 (~ 30 ° d’inclinaison). Une différence structurelle majeure a été observée dans la boucle β1-β2 longue de 34 acides aminés (280 à 313) qui relie β1 à β2 dans le groupe de feuilles β à six brins du domaine GAF-B (Fig. 2D et fig. S4B). La boucle GAF-B β1-β2 d'une sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ interagit directement avec le domaine catalytique de l'autre sous-unité (figure 2G). Cette interférence est médiée par l'architecture entrelacée de l'hétérodimère PDE6αβ, où les hélices LH2 se croisent sur le pseudo-double axe, de sorte que le domaine catalytique d'une sous-unité se trouve directement sous le domaine GAF-B de l'autre sous-unité de l'hétérodimère (Fig. 1, B et C et 2A). La région d'interaction de la boucle GAF-B β1-β2 adopte une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique (figure 2G). L'interaction directe suggère une voie potentielle de transduction du signal allostérique du GAF-A lié au GMPc au domaine catalytique via le GAF-B. Cette caractéristique fait du complexe PDE6αβ2γ la seule isoenzyme PDE montrant la deuxième association directe entre le domaine GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase, en plus de l’hélice LH2 qui relie les deux domaines. Cette découverte suggère un rôle de la boucle β1-β2 de GAF-B dans la régulation directe des domaines catalytiques de la PDE6, en convertissant le signal allostérique des domaines liés à la GAF-A liés au GMPc aux domaines catalytiques.\nL'hélice α5 C-terminal de GAF-B (414 à 441) est liée à l'hélice α-N du terminal du domaine catalytique (558 à 577) par l'intermédiaire de l'hélice LH2 et d'une région à hélice boucle-hélice comprenant un faisceau à quatre hélices. (Figures 1C et 2, A et D). La structure tout-α-hélicoïdale du domaine catalytique dans la PDE6 (PDE6a, 558 à 799; PDE6β, 556 à 796) est structurellement conservée avec les structures cristallines publiées antérieurement des domaines catalytiques de plusieurs isoenzymes de la PDE (24, 29). Cependant, un changement de conformation substantiel a été observé dans la région de la boucle H (606 à 629) qui borde le site de liaison au substrat (Fig. 3C). La boucle en H est une boucle caractéristique qui change de conformation lors de la liaison du ligand. Pendant l'activation de PDE2A, la boucle H bascule et atteint une conformation en boucle ouverte qui permet la liaison d'un substrat ou d'un inhibiteur au domaine catalytique de la PDE (Fig. 3C) (Figure 3C).24). Alors que pendant l'inactivation de PDE2A, la boucle en H ferme la poche de liaison au substrat, ce qui entraîne la désactivation de l'isoenzyme (Fig. 3C) (Fig. 3C) (24). Contrairement à la structure de PDE2A à état fermé, la boucle H du complexe PDE6αβ2γ présente une conformation ouverte rappelant l’état lié au substrat / inhibiteur des domaines catalytiques PDE2A et PDE5 (Fig. 3, C et D, et fig. 3). S5). Cette conformation en boucle H ouverte est stabilisée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ qui se lie à proximité du site de liaison au substrat et ferme la liaison au substrat (figure 3D).\nContrairement à la structure à l'état fermé de l'homodimère PDE2A, la région de boucle M (745 à 767) qui connecte a14 et a15 du domaine catalytique ne participe pas à la formation d'hétérodimère dans le complexe PDE6αβ2γ (figure 4A). À la lumière de l'interaction directe des boucles GAF β1-β2 reliant le GAF-A régulateur lié au cGMP au domaine catalytique à travers le domaine GAF-B du complexe PDE62αβγ et la comparaison avec l'état fermé de PDE2A (figure 4A) (Figure 4A).24), on peut en déduire un modèle d’activation allostérique des isoenzymes de la PDE afin de révéler les modifications conformationnelles représentatives (Fig. 4B). Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° de LH1 vers l’intérieur, une rotation de 80 ° vers l’extérieur de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° des domaines catalytiques ( Fig. 4A). Cependant, le réarrangement des domaines catalytiques est peu probable lors de l'activation allostérique de la PDE6 en raison de son association avec la PDE6γ. Pour tenter de visualiser certains de ces changements structurels, nous avons effectué une cryo-EM sur le complexe PDE6αβ2γ en présence d'un excès molaire de sildénafil cinq fois supérieur. Les moyennes des classes 2D à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ traité au sildénafil montrent une densité réduite de la boucle GAF-B β1-β2 associée à sa flexibilité accrue (Fig. 4C; comparez les panneaux marqués d'un astérisque). Les changements structurels observés concordent avec une occupation partielle du sildénafil dans le site catalytique du complexe PDE6αβ2γ en raison d’une compétition avec la sous-unité inhibitrice de PDE6γ pour le même site de liaison (30). Notamment, les domaines catalytiques n'ont pas montré de changements structurels notables, probablement à cause de la PDE6γ partiellement liée qui stabilise le complexe PDE6αβ2γ dans son état ouvert. Globalement, ces résultats confirment le rôle des boucles GAF β1-β2 dans la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE.
"},{"id":"text-9","type":"text","heading":"","plain_text":"Fig. 4 La boucle β1-β2 des domaines GAF régulateurs en tant que déclencheurs allostériques potentiels de la régulation allostérique de la PDE.\n(UNE) Comparaison entre les structures globales de l'homodimère PDE2A à l'état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ. Les régions à boucles M de PDE2A à état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ sont représentées en or. (B) Représentation schématique montrant l’ampleur des changements de conformation potentiels pouvant survenir lors de l’activation de la PDE. Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° vers l’intérieur de la bobine enroulée LH1, une torsion de 80 ° vers l’arrière de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° de la boucle. domaines catalytiques. Les régions de la boucle M sont indiquées en or. (C) Une comparaison entre les moyennes de classe 2D du complexe PDE6αβ2γ non traité et de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil résume certaines des principales différences structurelles illustrées en (B). Les vues de face de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil présentent des modifications du profil d’interaction de la boucle GAF-B β1-β2 avec le domaine catalytique du noyau hétérodimère PDE6αβ. Les boucles GAF-B β1-β2 sont désignées par des astérisques. Barre d'échelle, 60 Å.","html":"Fig. 4 La boucle β1-β2 des domaines GAF régulateurs en tant que déclencheurs allostériques potentiels de la régulation allostérique de la PDE.\n(UNE) Comparaison entre les structures globales de l'homodimère PDE2A à l'état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ. Les régions à boucles M de PDE2A à état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ sont représentées en or. (B) Représentation schématique montrant l’ampleur des changements de conformation potentiels pouvant survenir lors de l’activation de la PDE. Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° vers l’intérieur de la bobine enroulée LH1, une torsion de 80 ° vers l’arrière de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° de la boucle. domaines catalytiques. Les régions de la boucle M sont indiquées en or. (C) Une comparaison entre les moyennes de classe 2D du complexe PDE6αβ2γ non traité et de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil résume certaines des principales différences structurelles illustrées en (B). Les vues de face de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil présentent des modifications du profil d’interaction de la boucle GAF-B β1-β2 avec le domaine catalytique du noyau hétérodimère PDE6αβ. Les boucles GAF-B β1-β2 sont désignées par des astérisques. Barre d'échelle, 60 Å.
"},{"id":"text-10","type":"text","heading":"","plain_text":"DISCUSSION\nCette étude fournit des informations structurelles sur la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE6 par les domaines GAF N-terminaux et la sous-unité PDE6γ. Une comparaison de la structure du complexe PDE6αβ2γ avec la structure à l'état fermé de PDE2A montre la réorganisation des régions de boucle GAF β1-β2 qui forment des routes de transduction de signal allostérique potentielles de GAF-A au domaine catalytique par le domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP ( Fig. 4). Ces signaux allostériques sont ensuite traduits en mouvement vers l'extérieur de la région de boucle en H qui permet la liaison et l'hydrolyse du substrat (figures 3 et 4). Les domaines régulateurs N-terminaux sont essentiels pour réguler étroitement la signalisation des nucléotides cycliques par les isoenzymes de la PDE. La famille PDE de type I comprend une variété de domaines N-terminaux, notamment des domaines de liaison calcium / calmoduline, des régions conservées en amont régulées par une protéine kinase et des domaines GAF. Cependant, la régulation allostérique de la majorité des PDE est régie par les domaines GAF N-terminaux (fig. S1). Notamment, l'activation de PDE2A est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-B, alors que l'activation de PDE5 induite par le GMPc est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-A. D'autre part, l'activation de PDE6 est plus complexe et implique la liaison de Gαt-GTP, qui libère la contrainte inhibitrice de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16) et réduit l’affinité de liaison du GMPc à l’un des deux domaines GAF-A. Par conséquent, le modèle proposé affichant les modifications structurelles représentatives associées à la régulation allostérique de la PDE (figure 4B) est probablement limité aux homologues structurels étroitement apparentés de la PDE6.\nLa structure du complexe PDE6αβ2γ présente plusieurs caractéristiques en accord avec les données de reticulation chimique et de spectrométrie de masse publiées précédemment (31). Ces caractéristiques incluent une organisation en tandem des domaines GAF, une organisation parallèle des deux sous-unités catalytiques et la présence de segments hélicoïdaux juxtaposés dans l'hétérodimère PDE6αβ (31). PDE6 est le seul membre de la famille PDE de type I dont les sous-unités inhibitrices sont liées au dimère catalytique (32). Des études de réticulation antérieures ont indiqué la capacité de PDE6γ à se lier aux domaines catalytiques de l’hétérodimère PDE6αβ, ses résidus C-terminaux bloquant ainsi la poche de liaison au substrat (30). La liaison à la PDE6γ a également été proposée pour moduler la liaison du GMPc au niveau du domaine régulateur GAF-A (33). Ce contrôle allostérique interdomaine inhabituel pour un polypeptide PDE6γ de 9,7 kDa a souvent été débattu en raison du manque de preuves structurelles. Cette étude fournit la confirmation structurelle directe que PDE6γ adopte une conformation étendue et en grande partie non structurée pour permettre son interaction à la fois avec la poche de liaison au GMPc de GAF-A et le domaine catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ. De plus, l'interaction de PDE6γ C-terminus avec les sous-unités catalytiques stabilise la conformation à l'état ouvert du complexe PDE6αβ2γ.\nGlobalement, la structure à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ et sa comparaison avec la structure PDE2A à l'état fermé fournissent un cadre structurel solide pour la conception rationnelle de molécules candidates sélectives pour des isoenzymes de PDE spécifiques afin d'atténuer les effets secondaires induits par les approches thérapeutiques conventionnelles.","html":"DISCUSSION\nCette étude fournit des informations structurelles sur la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE6 par les domaines GAF N-terminaux et la sous-unité PDE6γ. Une comparaison de la structure du complexe PDE6αβ2γ avec la structure à l'état fermé de PDE2A montre la réorganisation des régions de boucle GAF β1-β2 qui forment des routes de transduction de signal allostérique potentielles de GAF-A au domaine catalytique par le domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP ( Fig. 4). Ces signaux allostériques sont ensuite traduits en mouvement vers l'extérieur de la région de boucle en H qui permet la liaison et l'hydrolyse du substrat (figures 3 et 4). Les domaines régulateurs N-terminaux sont essentiels pour réguler étroitement la signalisation des nucléotides cycliques par les isoenzymes de la PDE. La famille PDE de type I comprend une variété de domaines N-terminaux, notamment des domaines de liaison calcium / calmoduline, des régions conservées en amont régulées par une protéine kinase et des domaines GAF. Cependant, la régulation allostérique de la majorité des PDE est régie par les domaines GAF N-terminaux (fig. S1). Notamment, l'activation de PDE2A est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-B, alors que l'activation de PDE5 induite par le GMPc est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-A. D'autre part, l'activation de PDE6 est plus complexe et implique la liaison de Gαt-GTP, qui libère la contrainte inhibitrice de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16) et réduit l’affinité de liaison du GMPc à l’un des deux domaines GAF-A. Par conséquent, le modèle proposé affichant les modifications structurelles représentatives associées à la régulation allostérique de la PDE (figure 4B) est probablement limité aux homologues structurels étroitement apparentés de la PDE6.\nLa structure du complexe PDE6αβ2γ présente plusieurs caractéristiques en accord avec les données de reticulation chimique et de spectrométrie de masse publiées précédemment (31). Ces caractéristiques incluent une organisation en tandem des domaines GAF, une organisation parallèle des deux sous-unités catalytiques et la présence de segments hélicoïdaux juxtaposés dans l'hétérodimère PDE6αβ (31). PDE6 est le seul membre de la famille PDE de type I dont les sous-unités inhibitrices sont liées au dimère catalytique (32). Des études de réticulation antérieures ont indiqué la capacité de PDE6γ à se lier aux domaines catalytiques de l’hétérodimère PDE6αβ, ses résidus C-terminaux bloquant ainsi la poche de liaison au substrat (30). La liaison à la PDE6γ a également été proposée pour moduler la liaison du GMPc au niveau du domaine régulateur GAF-A (33). Ce contrôle allostérique interdomaine inhabituel pour un polypeptide PDE6γ de 9,7 kDa a souvent été débattu en raison du manque de preuves structurelles. Cette étude fournit la confirmation structurelle directe que PDE6γ adopte une conformation étendue et en grande partie non structurée pour permettre son interaction à la fois avec la poche de liaison au GMPc de GAF-A et le domaine catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ. De plus, l'interaction de PDE6γ C-terminus avec les sous-unités catalytiques stabilise la conformation à l'état ouvert du complexe PDE6αβ2γ.\nGlobalement, la structure à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ et sa comparaison avec la structure PDE2A à l'état fermé fournissent un cadre structurel solide pour la conception rationnelle de molécules candidates sélectives pour des isoenzymes de PDE spécifiques afin d'atténuer les effets secondaires induits par les approches thérapeutiques conventionnelles.
"},{"id":"text-11","type":"text","heading":"","plain_text":"MATÉRIAUX ET MÉTHODES","html":"MATÉRIAUX ET MÉTHODES
"},{"id":"text-12","type":"text","heading":"","plain_text":"Purification de PDE6\nToutes les procédures expérimentales ont été effectuées dans une chambre noire sous une lumière rouge tamisée (> 670 nm). Les ROS bovines ont été préparées comme décrit ailleurs (34). Les ROS ont été dilués dans un tampon isotonique contenant Hepes 20 mM (pH 7,5), MgCl 5 mM.2, 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 100 mM de NaCl. La suspension a ensuite été centrifugée à 30 000 ° C.g à 25 ° C pendant 25 min pour éliminer les protéines solubles et certaines protéines associées à la membrane (35, 36). Le culot a été remis en suspension dans un tampon hypotonique contenant Hepes 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM et DTT 1 mM et homogénéisé doucement trois fois en faisant passer manuellement la suspension dans un homogénéisateur verre à verre. L'homogénat a été centrifugé à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C. Les surnageants des deux lavages hypotoniques ont été rassemblés et centrifugés plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant limpide a été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.2et 1 mM de DTT pendant 3 heures à 4 ° C. La solution hypotonique a été complétée par des membranes ROS (25 µM de rhodopsine) et 250 µM de GTPγS (Sigma-Aldrich), puis par une illumination de lumière pendant 30 minutes avec une lumière de fibre de 150 W (NCL-150, Volpi, États-Unis) délivrées via un filtre 480 – filtre passe-bande à 520 nm (Chroma Technology Corporation, États-Unis). La remise en suspension a ensuite été centrifugée plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant a été chargé sur une colonne C10 / 10 (GE Healthcare) avec 6 ml de résine propyl-agarose pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2et 1 mM DTT. Ensuite, la colonne a été lavée avec 30 volumes de résine du tampon d'équilibrage suivis de 2 volumes de résine de tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, DTT 1 mM et NaCl 50 mM. Les protéines liées ont été éluées avec 30 ml de tampon d'équilibrage contenant 0,4 M de NaCl. L'éluat a ensuite été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.21 mM EDTA et 1 mM DTT.\nL'éluat dialyse a été chargé sur une colonne C10 / 20 (GE Healthcare) avec 15 ml de résine Blue Sepharose CL-6B (Sigma-Aldrich) prééquilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM21 mM EDTA et 1 mM DTT. Le flux continu a été complété par un nanocorps qui se lie spécifiquement à Gβ1γ1 (37) pour le retirer de l'échantillon (fig. S3). Après 30 min d’incubation, Ni2+–La résine d'acide nitrilotriacétique pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM2On a ajouté 1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT. Après 30 min d’incubation, la résine liée à Gβ1γ1 a été éliminé en passant la remise en suspension à travers une colonne jetable de Pierce (Thermo Fisher Scientific). L'écoulement contenant Gαt et PDE6 obtenus à partir du Ni immobilisé2+ La chromatographie d'affinité a ensuite été concentrée et chargée sur une colonne Superdex 200 10/300 GL équilibrée avec un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, 1 mM de DTT et 100 mM de NaCl (fig. S3, A et B). Les fractions contenant la PDE6 ont été combinées, concentrées à environ 0,7 mg ml−1, et utilisé pour les analyses cryo-EM. La caractérisation fonctionnelle de PDE6 a été décrite précédemment (26, 38).","html":"Purification de PDE6\nToutes les procédures expérimentales ont été effectuées dans une chambre noire sous une lumière rouge tamisée (> 670 nm). Les ROS bovines ont été préparées comme décrit ailleurs (34). Les ROS ont été dilués dans un tampon isotonique contenant Hepes 20 mM (pH 7,5), MgCl 5 mM.2, 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 100 mM de NaCl. La suspension a ensuite été centrifugée à 30 000 ° C.g à 25 ° C pendant 25 min pour éliminer les protéines solubles et certaines protéines associées à la membrane (35, 36). Le culot a été remis en suspension dans un tampon hypotonique contenant Hepes 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM et DTT 1 mM et homogénéisé doucement trois fois en faisant passer manuellement la suspension dans un homogénéisateur verre à verre. L'homogénat a été centrifugé à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C. Les surnageants des deux lavages hypotoniques ont été rassemblés et centrifugés plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant limpide a été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.2et 1 mM de DTT pendant 3 heures à 4 ° C. La solution hypotonique a été complétée par des membranes ROS (25 µM de rhodopsine) et 250 µM de GTPγS (Sigma-Aldrich), puis par une illumination de lumière pendant 30 minutes avec une lumière de fibre de 150 W (NCL-150, Volpi, États-Unis) délivrées via un filtre 480 – filtre passe-bande à 520 nm (Chroma Technology Corporation, États-Unis). La remise en suspension a ensuite été centrifugée plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant a été chargé sur une colonne C10 / 10 (GE Healthcare) avec 6 ml de résine propyl-agarose pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2et 1 mM DTT. Ensuite, la colonne a été lavée avec 30 volumes de résine du tampon d'équilibrage suivis de 2 volumes de résine de tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, DTT 1 mM et NaCl 50 mM. Les protéines liées ont été éluées avec 30 ml de tampon d'équilibrage contenant 0,4 M de NaCl. L'éluat a ensuite été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.21 mM EDTA et 1 mM DTT.\nL'éluat dialyse a été chargé sur une colonne C10 / 20 (GE Healthcare) avec 15 ml de résine Blue Sepharose CL-6B (Sigma-Aldrich) prééquilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM21 mM EDTA et 1 mM DTT. Le flux continu a été complété par un nanocorps qui se lie spécifiquement à Gβ1γ1 (37) pour le retirer de l'échantillon (fig. S3). Après 30 min d’incubation, Ni2+–La résine d'acide nitrilotriacétique pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM2On a ajouté 1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT. Après 30 min d’incubation, la résine liée à Gβ1γ1 a été éliminé en passant la remise en suspension à travers une colonne jetable de Pierce (Thermo Fisher Scientific). L'écoulement contenant Gαt et PDE6 obtenus à partir du Ni immobilisé2+ La chromatographie d'affinité a ensuite été concentrée et chargée sur une colonne Superdex 200 10/300 GL équilibrée avec un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, 1 mM de DTT et 100 mM de NaCl (fig. S3, A et B). Les fractions contenant la PDE6 ont été combinées, concentrées à environ 0,7 mg ml−1, et utilisé pour les analyses cryo-EM. La caractérisation fonctionnelle de PDE6 a été décrite précédemment (26, 38).
"},{"id":"text-13","type":"text","heading":"","plain_text":"Préparation d'échantillons Cryo-EM, acquisition de données et traitement de films\nTrois microlitres de PDE6αβ2γ ou PDE6αβ2γ purifié avec un excès de 5 M de sildénafil à une concentration de 0,7 mg ml−1 ont été appliqués sur une grille Quantifoil R2 / 2 400 mesh (Electron Microscopy Sciences) sans décharge luminescente préalable. Les grilles ont été congelées dans de l'éthane liquide avec du FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) dans les conditions suivantes: température de 4 ° C; humidité 100%; temps de transfert, 2 s; et force de buvard réglée à -10. Des grilles gelées ont été imagées dans un Titan Krios FEI (300 kV, Thermo Fisher Scientific) équipé d'un filtre d'énergie Gatan Quantum-LS (filtrage zéro perte à 20 eV) connecté à un détecteur Gatan K2 Summit fonctionnant en mode de comptage à super-résolution. Des séquences vidéo super-résolution de 50 images ont été acquises avec un grossissement de × 47 259 en mode nanosonde à l’aide du logiciel SerialEM (39). Une dose totale de 80 e– UNE−2 et une taille de pixel de 0,529 Å pour les pixels de super-résolution ont été utilisés lors de la collecte de données (fig. S3C). Les vidéos acquises ont été traitées pendant la session d’imagerie avec le programme Focus (40), qui comprenait (i) une application de référence de gain et un binning 2 × des programmes clip et resample_mp.exe de l’IMOD (41) et Frealign (42) les colis, respectivement; ii) correction de mouvement et pondération de la dose par MotionCor2 (43) et iii) estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) par CTFFIND4 (44). Au total, 3134 films alignés ont été utilisés pour un traitement supplémentaire à une seule particule. Les images affichant une résolution inférieure à 7 Å lors de la correction CTF ou des dérives moyennes supérieures à 2 Å par image ont été exclues de l'analyse.","html":"Préparation d'échantillons Cryo-EM, acquisition de données et traitement de films\nTrois microlitres de PDE6αβ2γ ou PDE6αβ2γ purifié avec un excès de 5 M de sildénafil à une concentration de 0,7 mg ml−1 ont été appliqués sur une grille Quantifoil R2 / 2 400 mesh (Electron Microscopy Sciences) sans décharge luminescente préalable. Les grilles ont été congelées dans de l'éthane liquide avec du FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) dans les conditions suivantes: température de 4 ° C; humidité 100%; temps de transfert, 2 s; et force de buvard réglée à -10. Des grilles gelées ont été imagées dans un Titan Krios FEI (300 kV, Thermo Fisher Scientific) équipé d'un filtre d'énergie Gatan Quantum-LS (filtrage zéro perte à 20 eV) connecté à un détecteur Gatan K2 Summit fonctionnant en mode de comptage à super-résolution. Des séquences vidéo super-résolution de 50 images ont été acquises avec un grossissement de × 47 259 en mode nanosonde à l’aide du logiciel SerialEM (39). Une dose totale de 80 e– UNE−2 et une taille de pixel de 0,529 Å pour les pixels de super-résolution ont été utilisés lors de la collecte de données (fig. S3C). Les vidéos acquises ont été traitées pendant la session d’imagerie avec le programme Focus (40), qui comprenait (i) une application de référence de gain et un binning 2 × des programmes clip et resample_mp.exe de l’IMOD (41) et Frealign (42) les colis, respectivement; ii) correction de mouvement et pondération de la dose par MotionCor2 (43) et iii) estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) par CTFFIND4 (44). Au total, 3134 films alignés ont été utilisés pour un traitement supplémentaire à une seule particule. Les images affichant une résolution inférieure à 7 Å lors de la correction CTF ou des dérives moyennes supérieures à 2 Å par image ont été exclues de l'analyse.
"},{"id":"text-14","type":"text","heading":"","plain_text":"Traitement d'image\nLes particules micrographiques ont été sélectionnées avec le boxer EMAN2 (45) et Gautomatch (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/). During the initial processing, 2176 particles were automatically selected from 100 preselected images with reference-free Gautomatch localization. The selected particles were inspected with the e2boxer.py script and 2D classified in Relion 2.1 (46). A few high-resolution 2D classes were low-pass–filtered to 30 Å and used as templates for Gautomatch particle selection on all aligned images. This larger dataset of particles was 2D classified in Relion 2.1, and 30 high-resolution class averages covering a broader range of views were selected as templates for another round of Gautomatch particle selection. The final particle selection resulted in a total of 197,171 particles, which were reprocessed with Relion 2.1. After seven rounds of 2D classification, a 2D class average representing the face-view of PDE6 (fig. S3D) was used to create a rotationally symmetric starting model for 3D processing. The Fourier transform of the selected projection was low-pass–filtered to 60 Å and rotated around the long axis of the class average. The created 3D Fourier volume was back-transformed to obtain the initial real-space 3D model.\nThe 2D class averages comprising 85,929 particles were subjected to three rounds of 3D classification with the 60-Å rotationally symmetric model as a reference (fig. S6A). The resulting five 3D classes were used to generate the initial map of PDE6 at a resolution of 8.2 Å, which was subjected to the e2project.py script of EMAN2 to compute 30 reprojections covering views from all directions to serve as templates for the final round of Gautomatch particle selection. The final dataset comprising 199,658 particles was processed by Relion 2.1. Five rounds of 2D classification reduced the dataset to 82,558 particles, which were subjected to three rounds of 3D classification (with seven, five, and five 3D classes, respectively) with the rotationally symmetric initial 3D model as a reference (fig. S6A). Two identical 3D classes displaying a resolution of 8.3 Å and comprising a total of 43,597 particles were combined into a single dataset. The combined dataset was then refined against one of the two 8.3-Å 3D classes, which was low-pass–filtered to 35 Å. Upon masking and modulation transfer function correction, the reconstructions reached a resolution of 4.1 Å, as measured by Fourier shell correlation (FSC) of a refinement in which two halves of the dataset were refined separately and combined only when building the final map (fig. S6A). The same dataset was then reprocessed with the cisTEM program (47) that uses per-particle CTF refinement and B-factor particle weighting. The final 3D reconstruction reached a resolution of 3.4 Å at an FSC of 0.143 (fig. S6B) (48). Local resolution distribution of the final map was determined by ResMap (49). The data acquisition and processing of PDE6αβ2γ treated with sildenafil was done under identical conditions as the untreated PDE6αβ2γ holoenzyme. In total, 4780 images were acquired, from which 223,656 particles were isolated and subjected to 2D classification.","html":"Traitement d'image\nLes particules micrographiques ont été sélectionnées avec le boxer EMAN2 (45) et Gautomatch (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/). During the initial processing, 2176 particles were automatically selected from 100 preselected images with reference-free Gautomatch localization. The selected particles were inspected with the e2boxer.py script and 2D classified in Relion 2.1 (46). A few high-resolution 2D classes were low-pass–filtered to 30 Å and used as templates for Gautomatch particle selection on all aligned images. This larger dataset of particles was 2D classified in Relion 2.1, and 30 high-resolution class averages covering a broader range of views were selected as templates for another round of Gautomatch particle selection. The final particle selection resulted in a total of 197,171 particles, which were reprocessed with Relion 2.1. After seven rounds of 2D classification, a 2D class average representing the face-view of PDE6 (fig. S3D) was used to create a rotationally symmetric starting model for 3D processing. The Fourier transform of the selected projection was low-pass–filtered to 60 Å and rotated around the long axis of the class average. The created 3D Fourier volume was back-transformed to obtain the initial real-space 3D model.\nThe 2D class averages comprising 85,929 particles were subjected to three rounds of 3D classification with the 60-Å rotationally symmetric model as a reference (fig. S6A). The resulting five 3D classes were used to generate the initial map of PDE6 at a resolution of 8.2 Å, which was subjected to the e2project.py script of EMAN2 to compute 30 reprojections covering views from all directions to serve as templates for the final round of Gautomatch particle selection. The final dataset comprising 199,658 particles was processed by Relion 2.1. Five rounds of 2D classification reduced the dataset to 82,558 particles, which were subjected to three rounds of 3D classification (with seven, five, and five 3D classes, respectively) with the rotationally symmetric initial 3D model as a reference (fig. S6A). Two identical 3D classes displaying a resolution of 8.3 Å and comprising a total of 43,597 particles were combined into a single dataset. The combined dataset was then refined against one of the two 8.3-Å 3D classes, which was low-pass–filtered to 35 Å. Upon masking and modulation transfer function correction, the reconstructions reached a resolution of 4.1 Å, as measured by Fourier shell correlation (FSC) of a refinement in which two halves of the dataset were refined separately and combined only when building the final map (fig. S6A). The same dataset was then reprocessed with the cisTEM program (47) that uses per-particle CTF refinement and B-factor particle weighting. The final 3D reconstruction reached a resolution of 3.4 Å at an FSC of 0.143 (fig. S6B) (48). Local resolution distribution of the final map was determined by ResMap (49). The data acquisition and processing of PDE6αβ2γ treated with sildenafil was done under identical conditions as the untreated PDE6αβ2γ holoenzyme. In total, 4780 images were acquired, from which 223,656 particles were isolated and subjected to 2D classification.
"},{"id":"text-15","type":"text","heading":"","plain_text":"Model building and refinement\nThe cryo-EM map was put into an artificial crystal lattice to calculate its structure factor using the phenix.map_to_structure_factors script in the PHENIX program (50). The 3D density map was sharpened by applying a negative B-factor of −148 Å2 as determined with the phenix.auto_sharpen script (50) and by manual intervention. De novo modeling of PDE6α, PDE6β, and PDE6γ subunits was performed in Coot 0.8.8 (51) using secondary structure predictions calculated by PSIPRED (52). The densities of bulky side chains were used as references during the backbone tracing. A partial PDE6 model (PDE6α, 10 to 822; PDE6β, 11 to 822; and PDE6γ 1 to 30 and 70 to 87) was used for rigid body fitting into the 3D density map with Chimera (53). The model was then refined by rigid body refinement of individual chains in the PHENIX program (50), where the amplitudes and phases of the structural factors were used as pseudo-experimental diffraction data for model refinement. Initial models were improved by multiple rounds of PHENIX real-space refinement (50) and REFMAC version 5.8 (54) refinement against the overall map at a resolution of 3.4 Å. Each round of refinement was followed by manual model building and adjustments with Coot 0.8.8 (51). Simultaneous optimization of the stereochemical and molecular clashes was performed during the refinements, resulting in a final model to map a cross-correlation coefficient of 0.79 (fig. S6C).\nThe stereochemical quality of the final PDE6αβ2γ complex model was assessed with the Molprobity server (55). The final PDE6αβ2γ model was cross-validated with previously available crystal structures of GAF-A (27, 28), GAF-B (27, 56), and catalytic (29, 30) domains of PDE family members. Details of the cryo-EM data collection and structural refinement statistics are provided in table S1. Protein coordinates and the EM map were deposited in the Protein Data Bank (PDB) (PDB accession number: 6MZB and Electron Microscopy Data Bank ID: EMD-9297). The raw image data have been deposited in the Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) database (www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/; access number: EMPIAR-10228). All structural and density representations were generated using either Chimera (53) or Pymol (www.pymol.org).","html":"Model building and refinement\nThe cryo-EM map was put into an artificial crystal lattice to calculate its structure factor using the phenix.map_to_structure_factors script in the PHENIX program (50). The 3D density map was sharpened by applying a negative B-factor of −148 Å2 as determined with the phenix.auto_sharpen script (50) and by manual intervention. De novo modeling of PDE6α, PDE6β, and PDE6γ subunits was performed in Coot 0.8.8 (51) using secondary structure predictions calculated by PSIPRED (52). The densities of bulky side chains were used as references during the backbone tracing. A partial PDE6 model (PDE6α, 10 to 822; PDE6β, 11 to 822; and PDE6γ 1 to 30 and 70 to 87) was used for rigid body fitting into the 3D density map with Chimera (53). The model was then refined by rigid body refinement of individual chains in the PHENIX program (50), where the amplitudes and phases of the structural factors were used as pseudo-experimental diffraction data for model refinement. Initial models were improved by multiple rounds of PHENIX real-space refinement (50) and REFMAC version 5.8 (54) refinement against the overall map at a resolution of 3.4 Å. Each round of refinement was followed by manual model building and adjustments with Coot 0.8.8 (51). Simultaneous optimization of the stereochemical and molecular clashes was performed during the refinements, resulting in a final model to map a cross-correlation coefficient of 0.79 (fig. S6C).\nThe stereochemical quality of the final PDE6αβ2γ complex model was assessed with the Molprobity server (55). The final PDE6αβ2γ model was cross-validated with previously available crystal structures of GAF-A (27, 28), GAF-B (27, 56), and catalytic (29, 30) domains of PDE family members. Details of the cryo-EM data collection and structural refinement statistics are provided in table S1. Protein coordinates and the EM map were deposited in the Protein Data Bank (PDB) (PDB accession number: 6MZB and Electron Microscopy Data Bank ID: EMD-9297). The raw image data have been deposited in the Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) database (www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/; access number: EMPIAR-10228). All structural and density representations were generated using either Chimera (53) or Pymol (www.pymol.org).
"},{"id":"text-16","type":"text","heading":"","plain_text":"SUPPLEMENTARY MATERIALS","html":"SUPPLEMENTARY MATERIALS
"},{"id":"text-17","type":"text","heading":"","plain_text":"Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/2/eaav4322/DC1\nFig. S1. Domain organization in the type I phosphodiesterase superfamily.\nFig. S2. Domain organization and primary sequence comparison between PDE6α and PDE6β subunits.\nFig. S3. Biochemical characterization and cryo-EM of the PD6αβ2γ complex.\nFig. S4. Structural features of regulatory GAF domains of the PDE6αβ2γ complex.\nFig. S5. Comparison between the H-loop orientations of PDE6 and PDE5.\nFig. S6. Cryo-EM reconstruction and data fitting of the PDE6αβ2γ complex.\nTable S1. Cryo-EM data collection, refinement, and validation statistics for the PDE6αβ2γ complex.","html":"Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/2/eaav4322/DC1\nFig. S1. Domain organization in the type I phosphodiesterase superfamily.\nFig. S2. Domain organization and primary sequence comparison between PDE6α and PDE6β subunits.\nFig. S3. Biochemical characterization and cryo-EM of the PD6αβ2γ complex.\nFig. S4. Structural features of regulatory GAF domains of the PDE6αβ2γ complex.\nFig. S5. Comparison between the H-loop orientations of PDE6 and PDE5.\nFig. S6. Cryo-EM reconstruction and data fitting of the PDE6αβ2γ complex.\nTable S1. Cryo-EM data collection, refinement, and validation statistics for the PDE6αβ2γ complex.
"},{"id":"text-18","type":"text","heading":"","plain_text":"This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is ne pas for commercial advantage and provided the original work is properly cited.","html":"This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is ne pas for commercial advantage and provided the original work is properly cited.
"},{"id":"text-19","type":"text","heading":"","plain_text":"Acknowledgments: We thank A. Sears, R. Zimmerman, and other members of the Palczewski laboratory for their helpful comments regarding this manuscript and J. Thorne-Wallis from C-CINA for assistance with the preparation of cryo-EM grids. K.P. is the Leopold Chair of Ophthalmology. Funding: This research was supported in part by grants from the National Institutes of Health (NIH) (R24EY024864 and R01EY027283 to K.P.) and Research to Prevent Blindness (RPB) to The Department of Ophthalmology at UCI, the Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR), Alcon Research Institute (ARI), and the Swiss Commission for Technology, and Innovation (CTI) grant 18272.1 PFLS-LS (H.S.). Author contributions: S.G. and K.P. designed the research and wrote the paper. S.G. performed the protein purifications and optimizations. S.G. prepared PDE6 samples for cryo-EM specimen preparation. S.G., L.K., and H.S. performed the cryo-EM work. L.K. did the cryo-EM data processing and contributed to the written paper. S.G. carried out de novo model building and refinement and analyzed the structure of the PDE6αβ2γ complex. A.E. made intellectual contributions to the study and contributed to the written paper. All authors reviewed and edited the manuscript. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data supporting the findings of this study are available within this paper. Additional data supporting the findings of this manuscript are available from the corresponding authors upon reasonable request. The cryo-EM map of PDE6αβ2γ complex has been deposited in the Electron Microscopy Data Bank under accession code EMD-9297. The modeled structure of the PDE6αβ2γ complex has been deposited at the PDB under accession code 6MZB. The cryo-EM movie files have been deposited at the EMPIAR under accession code EMPIAR-10228.","html":"Acknowledgments: We thank A. Sears, R. Zimmerman, and other members of the Palczewski laboratory for their helpful comments regarding this manuscript and J. Thorne-Wallis from C-CINA for assistance with the preparation of cryo-EM grids. K.P. is the Leopold Chair of Ophthalmology. Funding: This research was supported in part by grants from the National Institutes of Health (NIH) (R24EY024864 and R01EY027283 to K.P.) and Research to Prevent Blindness (RPB) to The Department of Ophthalmology at UCI, the Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR), Alcon Research Institute (ARI), and the Swiss Commission for Technology, and Innovation (CTI) grant 18272.1 PFLS-LS (H.S.). Author contributions: S.G. and K.P. designed the research and wrote the paper. S.G. performed the protein purifications and optimizations. S.G. prepared PDE6 samples for cryo-EM specimen preparation. S.G., L.K., and H.S. performed the cryo-EM work. L.K. did the cryo-EM data processing and contributed to the written paper. S.G. carried out de novo model building and refinement and analyzed the structure of the PDE6αβ2γ complex. A.E. made intellectual contributions to the study and contributed to the written paper. All authors reviewed and edited the manuscript. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data supporting the findings of this study are available within this paper. Additional data supporting the findings of this manuscript are available from the corresponding authors upon reasonable request. The cryo-EM map of PDE6αβ2γ complex has been deposited in the Electron Microscopy Data Bank under accession code EMD-9297. The modeled structure of the PDE6αβ2γ complex has been deposited at the PDB under accession code 6MZB. The cryo-EM movie files have been deposited at the EMPIAR under accession code EMPIAR-10228.
"},{"id":"text-20","type":"text","heading":"","plain_text":"Copyright © 2019 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC).","html":"Copyright © 2019 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC).
"},{"id":"text-21","type":"text","heading":"","plain_text":"Click to rate this post!\n \n [Total: 0 Average: 0]","html":"Click to rate this post!\n \n [Total: 0 Average: 0]
"}],"sections":[{"id":"text-1","heading":"Text","content":"Abstrait\nLes phosphodiestérases nucléotidiques cycliques (PDE) agissent en conjonction avec les adénylates / guanylates cyclases pour réguler les seconds messagers clés de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G. Les tentatives précédentes pour déterminer la structure intégrale des membres de la famille PDE à haute résolution ont été gênées par la flexibilité structurelle, en particulier dans leurs régions de liaison et leurs extrémités N-terminale et C-terminale. Par conséquent, la plupart des études sur les relations structure-activité se sont jusqu'ici concentrées sur les domaines catalytiques tronqués et conservés, plutôt que sur les domaines régulateurs qui régissent allostériquement l'activité de la plupart des EDP. Ici, nous avons utilisé la microscopie cryogénique à particule unique pour déterminer la structure du complexe PDE6αβ2γ de pleine longueur. La carte de densité finale résolue à 3,4 Â révèle plusieurs caractéristiques structurelles inédites, notamment un domaine N-terminal enroulé et l'interface des sous-unités PDE6γ avec l'hétérodimère PDE6αβ. La comparaison du complexe PDE6αβ2γ avec l'état fermé de PDE2A permet de mieux comprendre les changements conformationnels associés à l'activation allostérique des PDE de type I."},{"id":"text-2","heading":"Text","content":"INTRODUCTION\nLa famille des phosphodiestérases (PDE) présente un domaine de phosphohydrolase catalytique conservé, dont l’activité est contrôlée par diverses structures et mécanismes de régulation du domaine (1, 2) (fig. S1 et S2). En raison de leur association avec diverses pathologies et de leurs distributions cellulaires et subcellulaires distinctes, les PDE sont la cible de plusieurs médicaments largement utilisés et restent une cible majeure pour le développement de médicaments (3). La plupart des études sur les relations structure-activité se sont jusqu'ici concentrées sur leurs domaines catalytiques conservés qui partagent une homologie de séquence de 25 à 52% entre les membres de la famille de la PDE de type I. En conséquence, la plupart des inhibiteurs de la PDE présentent un degré substantiel de réactivité croisée au sein de la famille de la PDE (4, 5) et d’autres enzymes connexes (6). En particulier, les inhibiteurs de la PDE5, y compris le sildénafil et le vardénafil, sont largement utilisés pour le traitement de la dysfonction érectile et de l’hypertension pulmonaire (7). Cependant, les inhibiteurs de la PDE5 ont été associés à plusieurs effets secondaires oculaires, notamment une vision floue, des modifications de la vision des couleurs, des altérations transitoires de l’électrorétinogramme, une hyperhémie conjonctivale, des douleurs oculaires, une photophobie et, dans les cas extrêmes, des lésions du nerf optique (8). Ces effets secondaires sont médiés par la liaison d'inhibiteurs de la PDE5 à une phosphohydrolase étroitement apparentée, la PDE6 (9), avec environ 10% de l'effet inhibiteur comparé à la PDE5 (dix). La PDE6 est un composant essentiel de la phototransduction visuelle qui catalyse l'hydrolyse de la guanosine 3 ', 5'-monophosphate (GMPc) en GMP en réponse à la lumière (9, 11). La réduction de la concentration de GMPc entraîne la fermeture de Na+ et ca2+ canaux ioniques dans la membrane plasmique des photorécepteurs, conduisant à leur hyperpolarisation. En raison de son efficacité catalytique fonctionnant près de la limite de diffusion du GMPc et d’une activation environ 100 fois supérieure par la transducine (12), La PDE6 est cruciale pour la phototransduction visuelle. Le photorécepteur à bâtonnets PDE6 est une phosphohydrolase atypique constituée d’un noyau catalytique hétérodimère composé de sous-unités PDE6α et PDE6β (hétérodimère PDE6αβ) et de deux sous-unités inhibitrices PDE6γ (11). Tous les autres membres de la PDE de type I possèdent un noyau catalytique homodimère, y compris la PDE6 provenant de photorécepteurs à cônes, composé de deux sous-unités α '(13). Toutes les sous-unités catalytiques PDE6 contiennent deux domaines GAF réglementaires N-terminaux (GAF-A et GAF-B) et un domaine catalytique C-terminal (14). Les domaines GAF et les sous-unités PDE6γ inhibitrices étroitement liées régulent l’activité du domaine catalytique allostérique (15). La liaison du GMPc au domaine GAF-A de la PDE6 augmente l'affinité pour la sous-unité PDE6γ qui inhibe l'activité catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ lorsqu'elle est liée. Réciproquement, la liaison de PDE6γ aux sous-unités catalytiques hétérodimères de PDE6αβ augmente l’affinité du GMPc pour les sites non catalytiques, ce qui, à son tour, augmente l’affinité des domaines catalytiques pour PDE6γ (15–17). Au cours de la phototransduction, la transducine activée[Gα[Gα[Gα[Gαt-GTP (guanosine 5′-triphosphate)]réduit la contrainte inhibitrice de la région C-terminale de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16), entraînant une affinité de liaison réduite du GMPc à l’un des deux domaines de GAF-A et la libération de GMPc. Gαt-GTP s'est déjà montré capable de se lier aux résidus d'aminoacides 24 à 45 (18–21), 54 à 55 (22) et 55 à 62 (22) et l'extrémité C de PDE6γ (23). Parmi ces sites d’interaction, la région riche en glycine de PDE6γ (résidus 55 à 62) a été impliquée dans la facilitation de l’interaction de Gα.t-GTP avec la région polycationique N-terminale de PDE6γ (18–22).\nL'absence d'une compréhension détaillée de la modulation allostérique des isoenzymes de la PDE a limité le succès commercial des inhibiteurs de la PDE en raison de la réactivité croisée au sein de la famille des PDE. Plusieurs structures à haute résolution de domaines individuels d'isoenzymes PDE, notamment PDE1, PDE2, PDE3, PDE4, PDE5, PDE6, PDE7, PDE8, PDE9 et PDE10, sont disponibles (figure S1). Une structure cristalline de PDE2A presque complète comprenant à la fois des domaines GAF et catalytique a été rapportée précédemment (24). En outre, plusieurs structures de microscopie cryo – électronique à faible résolution (PDC6) décrivant l’architecture globale de l’isoenzyme ont été rapportées (14, 25, 26). Malgré la richesse des connaissances fournies par ces structures partielles, les relations structurelles entre les domaines de la réglementation et le domaine catalytique des membres de la famille des PDE restent floues."},{"id":"text-3","heading":"Text","content":"RÉSULTATS\nPour obtenir des informations structurelles sur ce mécanisme allostérique, nous avons purifié la PDE6 bovine native à partir de segments extérieurs de tige (ROS) et avons utilisé la cryo-EM pour déterminer la structure du complexe PDE6αβ2γ. La structure du complexe PDE6αβ2γ résolue à une résolution de 3,4 Å montre une organisation linéaire des trois domaines (GAF-A, GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase) reliés par des hélices α longues dans les sous-unités PDE6α et PDE6β (Fig. . 1). La structure globale de PDE6 montre une architecture trilobée avec chaque lobe correspondant aux domaines catalytiques GAF-A, GAF-B et phosphohydrolase de l'hétérodimère PDE6αβ (figures 1 et 2, A et D). L'hétérodimère PDE6αβ atteint une pseudo-symétrie double où les trois domaines de PDE6α et PDE6β sont organisés dans un arrangement tête à tête avec une dimension de 154 Å, de 115 Å et de 74 Å. L’interface hétérodimérique de l’hétérodimère PDE6αβ (~ 5036 Å2) s'étend sur toute la longueur de la molécule. Les principales interfaces se situent dans la structure hélicoïdale à queue de cheval N-terminal (motif Pt, ~ 895 Å2) et des hélices de liaison étendues reliant GAF-A à GAF-B (LH1; ~ 510 Å2) et GAF-B dans le domaine catalytique (LH2; ~ 685 Å2) de PDE6α et PDE6β. L'analyse de résolution locale de l'hétérodimère PDE6αβ montre une résolution meilleure que 3,4Å dans le noyau et 5 à 7Å dans les régions périphériques (figure 1A, en bas). Le motif Pt fait partie des régions les plus flexibles du complexe PDE6αβ2γ avec une résolution locale de 7 à 8 Å (Fig. 1A, en bas) et présente donc une incertitude dans le modèle de novo. Le modèle final est composé des résidus d'acides aminés 10 à 822 de PDE6α et de 11 à 822 de PDE6β (Fig. 1C). Les résidus d'acides aminés 2 à 9 et 823 à 856 de PDE6α ainsi que 2 à 10 et 823 à 850 de PDE6β n'ont pas pu être modélisés en raison de leur flexibilité. Cette flexibilité est illustrée par les moyennes de classe bidimensionnelle (2D) qui montrent un flou des extrémités C-terminales flexibles des PDE6α et PDE6β (fig. S3D, flèches). Ces longs hélices C-terminales s'étendent dans des directions opposées et servent de sites pour les modifications lipidiques qui ancrent la PDE6αβ2γ dans les membranes des disques ROS. Bien que la moyenne des hélices C-terminales de l'hétérodimère PDE6αβ ait été moyennée lors de la reconstruction cryo-EM 3D finale, il s'agit du premier exemple dans lequel des instantanés 2D de ces longs hélices C-terminaux ont été visualisés."},{"id":"text-4","heading":"Text","content":"Fig. 1 La structure cryo-EM du complexe ternaire PDE6αβ2γ à une résolution de 3,4 Å.\n(UNE) Reconstruction 3D cryo-EM globale du complexe PDE6αβ2γ affichant le domaine de queue de cheval N-terminal de 34 Å de long (motif Pt) (en haut) et la carte d’estimation de la résolution locale (en bas). Les touches de résolution sont étiquetées de 3.2 (bleu) à 8.0 Å (rouge). (B) Quatre vues orthogonales de la structure cryo-EM du complexe PDE6αβ2γ affichant PDE6α (violet), PDE6β (cyan vert) et deux molécules de sous-unités PDE6γ (rouge). (C) Structures de PDE6α (en haut, 10 à 822) et de PDE6β (en bas, 11 à 822) dans deux vues orthogonales représentées en dessin animé. Barre d'échelle, 30 Å."},{"id":"text-5","heading":"Text","content":"Fig. 2 Caractéristiques structurelles du complexe PDE6αβ2γ.\n(UNE) Structure de l'hétérodimère PDE6αβ montrant la distribution du domaine dans les sous-unités PDE6α (violet) et PDE6β (cyan vert) où les domaines régulateurs GAF sont suivis par le domaine catalytique de la phosphohydrolase dans une organisation trilobée. Une molécule de PDE6γ (ruban rouge) enveloppe individuellement PDE6α et PDE6β pour une régulation plus précise de l'activité de la PDE6. Une molécule de GMPc (sphères rouges) est liée à chacun des domaines GAF-A de l'hétérodimère PDE6αβ. (B) Vue agrandie de la poche de liaison du GMP-GAF-A montrant l’orientation de la molécule du GMPc (bâtons rouges) par rapport aux structures secondaires environnantes. La densité électronique correspondant à la molécule de GMPc a été calculée après le raffinement final et est affichée en gris. (C) Les domaines GAF-A liés au cGMP du complexe PDE6αβ2γ (à gauche) et de PDE6C (en gris, à droite) présentent un pont de sel entre la charge négative partielle de Asn114 carbonyl oxygène et le groupe guanidine de Arg93. Résidu d'acide aminé Asn114 fournit d'importantes liaisons hydrogène protéine-ligand spécifiques du GMPc qui stabilisent la liaison du GMPc. (ré) Schéma de topologie montrant les éléments de structure secondaires du motif Pt (gris), GAF-A (rouge), GAF-B (violet) et du domaine catalytique (vert). (E) Vue agrandie de la poche de liaison au cGMP (maille rouge) du domaine PDE6α GAF-A. L'extrémité N de PDE6γ (bande dessinée rouge) forme un couvercle sur la molécule de GMPc enterrée et empêche ainsi sa libération du domaine GAF-A jusqu'à ce qu'un gradient de concentration seuil de GMPc soit atteint dans la cellule. La densité électronique de l'extrémité N-terminale de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (F) Interface d’interaction entre la boucle GAF-A β1-β2 et le domaine GAF-B de PDE6α. PDE6γ (en rouge) agrafe l'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 avec le domaine GAF-B et détecte probablement les modifications associées à la liaison du GMPc dans le domaine GAF-A. La densité électronique affinée autour de la boucle GAF-A β1-β2 est affichée en gris. (g) L’interface entre la boucle GAF-B β1-β2 de PDE6α et le domaine catalytique de PDE6β présente une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique. La densité électronique affinée correspondant aux principaux résidus d’acides aminés est affichée en gris."},{"id":"text-6","heading":"Text","content":"La région N-terminale de l'hétérodimère PDE6αβ présente un motif Pt asymétrique à double brin qui s'étend sur plus de 34 Å de long (figure 1). Le motif Pt fournit probablement une stabilité structurelle à l'hétérodimère PDE6αβ en fournissant une interface d'interaction de ~ 895 Å2 entre les sous-unités PDE6α et PDE6β. L'asymétrie du motif Pt peut être attribuée à la faible identité de séquence entre les régions N-terminales des deux sous-unités de l'hétérodimère PDE6αβ, avec 27% d'identité dans les 70 premiers acides aminés, par rapport à 77,5% d'identité dans le reste de la séquence. (fig. S2). Le domaine GAF-A de l’hétérodimère PDE6αβ présente une similarité structurelle élevée avec les domaines GAF-A précédemment publiés de PDE2A (24), PDE5 (27) et PDE6C (28) avec des déviations quadratiques moyennes de 1,34, 1,17 et 1,12 Å, respectivement. Les caractéristiques structurelles conservées du domaine GAF-A comprennent un groupe de feuilles β antiparallèles avec un ordre de brins 3-2-1-6-5-4 (Fig. 2D et fig. S4A). Ce groupe de feuilles β est pris en sandwich par les hélices α1, α2 et α5 qui se trouvent vers l'interface hétérodimère, ainsi que par les hélices α3 et α4 du côté distal (Fig. 2A et fig. S4A). En comparaison avec les structures précédemment déterminées des domaines GAF-A, un changement structurel substantiel est observé dans la boucle longue de 14 acides aminés qui relie le β1 au brin β2 (boucle β1-β2) du gène β à six brins de GAF-A. -groupe de feuilles. La boucle β1-β2 de GAF-A interagit directement avec le brin β4 et la boucle β6-α5 du domaine régulateur de GAF-B, suggérant une voie potentielle de transduction du signal allostérique du domaine GAF-A au domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP (Fig. 2F).\nLa carte affinée de cryo-EM montre une molécule de GMPc liée au domaine GAF-A de PDE6α et de PDE6β (figures 2, A, B et 3A). Le groupe phosphate 3 ', 5'-cyclique du GMPc pointe vers les hélices α3 et α4, alors que son cycle guanine établit plusieurs contacts bien définis avec les brins β1 et β2 (Fig. 2B et fig. S4C). La molécule cGMP enterrée établit plusieurs contacts électrostatiques avec les chaînes latérales de Ser95, Asn114, Val166et Thr174 en plus des contacts hydrophobes avec Phe113, Phe134, Val140, Tyr172et M193 qui déterminent son orientation dans la poche de liaison du cGMP (Fig. 2B et fig. S4C). Comme observé dans la structure cristalline du domaine PDE6C GAF-A lié au cGMP (28), le domaine GAF-A de PDE6αβ2γ contient Asn114 bloqué en position par un pont de sel 3,0 Å entre la charge partiellement négative de son oxygène carbonyle et le groupe guanidine de Arg93 (Fig. 2C). La région polycationique N-terminale de PDE6γ se lie à proximité du site de liaison au GMPc de GAF-A, suggérant son rôle potentiel dans la prévention de la libération de GMPc lié à moins qu'un certain seuil de gradient de GMPc ne soit établi dans la cellule, abaissant ainsi la constante de dissociation. (Kré) de GMPc pour le domaine GAF-A (Fig. 2E et 3A). De plus, PDE6γ agrafe le site d'interaction de la boucle GAF-A β1-β2 au domaine GAF-B et détecte probablement les changements lors de la liaison du GMPc (figures 2, A et F et 3A). Une molécule de PDE6γ interagit exclusivement avec GAF-A et le domaine catalytique de la même sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ, suggérant une régulation allostérique plus étroite (Figs. 1B, 2A et 3A). Les sous-unités PDE6γ affichent une plage de résolution de 3,2 à 9 Å avec la résolution la plus élevée atteinte aux extrémités N et C-terminales en raison de leur interaction directe avec GAF-A et les domaines catalytiques, respectivement (figures 2, A, E et F). et 3, A et B). Les résidus d'acides aminés 30 à 70 de PDE6γ ont été omis du modèle de novo final du complexe PDE6αβ2γ en raison de la faible densité de cryo-EM près de cette région (Fig. 3, A et B). Cela pourrait s'expliquer par la nature flexible du segment polypeptidique et par l'absence de contacts d'interface directs avec l'hétérodimère PDE6αβ. Globalement, ces résultats suggèrent une communication directe entre les domaines régulateurs GAF-A et GAF-B liés au GMPc dans le complexe PDE6αβ2γ à travers la boucle β1-β2 de GAF-A."},{"id":"text-7","heading":"Text","content":"Fig. 3 La sous-unité PDE6γ stabilise la conformation à l'état ouvert de l'hétérodimère PDE6αβ.\n(UNE) Densité Cryo-EM (modèle gauche, surface rouge) et modèle de novo partiel (ruban rouge) de PDE6γ autour de l'hétérodimère PDE6αβ (PDE6α, violet; PDE6β, cyan vert). Une molécule de PDE6γ entoure PDE6α et PDE6β individuellement pour une régulation plus stricte de l’activité de la PDE6. (B) Carte d'estimation de résolution locale (à gauche) et modèle de novo partiel (à droite) de PDE6γ montrant une bonne corrélation entre la carte 3D et le modèle PDE6γ affiné. La densité de PDE6γ après le raffinement final est affichée en gris. (C) Comparaison entre les domaines catalytiques de PDE6α (violet), PDE2A à état fermé (rose, PDBID: 3IBJ) et PDE2A lié à l’inhibiteur (orange, PDB ID: 4D08) affichant différentes orientations de la boucle en H (606 à 629, gauche) et de la boucle M (745 à 767, à droite). Le domaine catalytique de PDE2A à l'état fermé montre la boucle en H repliée dans le site catalytique à proximité de la poche de liaison au substrat (maille noire). En revanche, le domaine catalytique de PDE6α présente une boucle H ouverte similaire à la structure cristalline de PDE2A liée à l'inhibiteur. La région M-loop de PDE6α (violet) présente une conformation similaire à celle de la structure PDE2A liée à l'inhibiteur (orange). Notamment, les résidus 840 à 850 de la boucle M de la structure cristalline de PDE2A à l'état fermé (rose) sont désordonnés. (ré) L’extrémité C de la PDE6γ (bande rouge) se lie près de la poche de liaison au substrat du domaine catalytique de la PDE6. La liaison de PDE6y au domaine catalytique de PDE6 imite une forme liée à un substrat / inhibiteur dans laquelle la boucle en H présente une conformation ouverte et la poche de liaison au substrat est bouchée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ. Les régions structurellement conservées du domaine catalytique (RMSD ≤ 0,2 Å entre PDE6α et PDE2A) sont indiquées en gris."},{"id":"text-8","heading":"Text","content":"L'hélice α5 C-terminal de GAF-A (206 à 232) est liée à l'hélice α1 de N-terminal de GAF-B (254 à 280) par LH1 (figures 1C et 2D). Bien que le domaine GAF-B conserve une topologie familière à celle des structures de domaine de PDE2A précédemment publiées du domaine GAF-B (RMSD = 1.120 Å entre 59 paires d’atomes élaguées) (24) et PDE5 (RMSD = 1.06 Å entre 56 paires d’atomes élagués) (27), des différences structurelles substantielles ont été observées dans l’orientation de LH1 (~ 20 ° d’inclinaison), α2 (~ 10 ° d’inclinaison) et LH2 (~ 30 ° d’inclinaison). Une différence structurelle majeure a été observée dans la boucle β1-β2 longue de 34 acides aminés (280 à 313) qui relie β1 à β2 dans le groupe de feuilles β à six brins du domaine GAF-B (Fig. 2D et fig. S4B). La boucle GAF-B β1-β2 d'une sous-unité de l'hétérodimère PDE6αβ interagit directement avec le domaine catalytique de l'autre sous-unité (figure 2G). Cette interférence est médiée par l'architecture entrelacée de l'hétérodimère PDE6αβ, où les hélices LH2 se croisent sur le pseudo-double axe, de sorte que le domaine catalytique d'une sous-unité se trouve directement sous le domaine GAF-B de l'autre sous-unité de l'hétérodimère (Fig. 1, B et C et 2A). La région d'interaction de la boucle GAF-B β1-β2 adopte une structure hélicoïdale courte à deux tours qui forme des interactions hydrophobes avec les hélices α6, α7, α8 et α9 du domaine catalytique (figure 2G). L'interaction directe suggère une voie potentielle de transduction du signal allostérique du GAF-A lié au GMPc au domaine catalytique via le GAF-B. Cette caractéristique fait du complexe PDE6αβ2γ la seule isoenzyme PDE montrant la deuxième association directe entre le domaine GAF-B et le domaine catalytique de la phosphohydrolase, en plus de l’hélice LH2 qui relie les deux domaines. Cette découverte suggère un rôle de la boucle β1-β2 de GAF-B dans la régulation directe des domaines catalytiques de la PDE6, en convertissant le signal allostérique des domaines liés à la GAF-A liés au GMPc aux domaines catalytiques.\nL'hélice α5 C-terminal de GAF-B (414 à 441) est liée à l'hélice α-N du terminal du domaine catalytique (558 à 577) par l'intermédiaire de l'hélice LH2 et d'une région à hélice boucle-hélice comprenant un faisceau à quatre hélices. (Figures 1C et 2, A et D). La structure tout-α-hélicoïdale du domaine catalytique dans la PDE6 (PDE6a, 558 à 799; PDE6β, 556 à 796) est structurellement conservée avec les structures cristallines publiées antérieurement des domaines catalytiques de plusieurs isoenzymes de la PDE (24, 29). Cependant, un changement de conformation substantiel a été observé dans la région de la boucle H (606 à 629) qui borde le site de liaison au substrat (Fig. 3C). La boucle en H est une boucle caractéristique qui change de conformation lors de la liaison du ligand. Pendant l'activation de PDE2A, la boucle H bascule et atteint une conformation en boucle ouverte qui permet la liaison d'un substrat ou d'un inhibiteur au domaine catalytique de la PDE (Fig. 3C) (Figure 3C).24). Alors que pendant l'inactivation de PDE2A, la boucle en H ferme la poche de liaison au substrat, ce qui entraîne la désactivation de l'isoenzyme (Fig. 3C) (Fig. 3C) (24). Contrairement à la structure de PDE2A à état fermé, la boucle H du complexe PDE6αβ2γ présente une conformation ouverte rappelant l’état lié au substrat / inhibiteur des domaines catalytiques PDE2A et PDE5 (Fig. 3, C et D, et fig. 3). S5). Cette conformation en boucle H ouverte est stabilisée par l'extrémité C-terminale de PDE6γ qui se lie à proximité du site de liaison au substrat et ferme la liaison au substrat (figure 3D).\nContrairement à la structure à l'état fermé de l'homodimère PDE2A, la région de boucle M (745 à 767) qui connecte a14 et a15 du domaine catalytique ne participe pas à la formation d'hétérodimère dans le complexe PDE6αβ2γ (figure 4A). À la lumière de l'interaction directe des boucles GAF β1-β2 reliant le GAF-A régulateur lié au cGMP au domaine catalytique à travers le domaine GAF-B du complexe PDE62αβγ et la comparaison avec l'état fermé de PDE2A (figure 4A) (Figure 4A).24), on peut en déduire un modèle d’activation allostérique des isoenzymes de la PDE afin de révéler les modifications conformationnelles représentatives (Fig. 4B). Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° de LH1 vers l’intérieur, une rotation de 80 ° vers l’extérieur de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° des domaines catalytiques ( Fig. 4A). Cependant, le réarrangement des domaines catalytiques est peu probable lors de l'activation allostérique de la PDE6 en raison de son association avec la PDE6γ. Pour tenter de visualiser certains de ces changements structurels, nous avons effectué une cryo-EM sur le complexe PDE6αβ2γ en présence d'un excès molaire de sildénafil cinq fois supérieur. Les moyennes des classes 2D à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ traité au sildénafil montrent une densité réduite de la boucle GAF-B β1-β2 associée à sa flexibilité accrue (Fig. 4C; comparez les panneaux marqués d'un astérisque). Les changements structurels observés concordent avec une occupation partielle du sildénafil dans le site catalytique du complexe PDE6αβ2γ en raison d’une compétition avec la sous-unité inhibitrice de PDE6γ pour le même site de liaison (30). Notamment, les domaines catalytiques n'ont pas montré de changements structurels notables, probablement à cause de la PDE6γ partiellement liée qui stabilise le complexe PDE6αβ2γ dans son état ouvert. Globalement, ces résultats confirment le rôle des boucles GAF β1-β2 dans la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE."},{"id":"text-9","heading":"Text","content":"Fig. 4 La boucle β1-β2 des domaines GAF régulateurs en tant que déclencheurs allostériques potentiels de la régulation allostérique de la PDE.\n(UNE) Comparaison entre les structures globales de l'homodimère PDE2A à l'état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ. Les régions à boucles M de PDE2A à état fermé et de l'hétérodimère PDE6αβ sont représentées en or. (B) Représentation schématique montrant l’ampleur des changements de conformation potentiels pouvant survenir lors de l’activation de la PDE. Ces changements conformationnels incluent un mouvement descendant de la boucle GAF-A β1-β2, une torsion de 10 ° vers l’intérieur de la bobine enroulée LH1, une torsion de 80 ° vers l’arrière de la boucle GAF-B β1-β2 et une rotation de 80 ° de la boucle. domaines catalytiques. Les régions de la boucle M sont indiquées en or. (C) Une comparaison entre les moyennes de classe 2D du complexe PDE6αβ2γ non traité et de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil résume certaines des principales différences structurelles illustrées en (B). Les vues de face de PDE6αβ2γ traité avec du sildénafil présentent des modifications du profil d’interaction de la boucle GAF-B β1-β2 avec le domaine catalytique du noyau hétérodimère PDE6αβ. Les boucles GAF-B β1-β2 sont désignées par des astérisques. Barre d'échelle, 60 Å."},{"id":"text-10","heading":"Text","content":"DISCUSSION\nCette étude fournit des informations structurelles sur la régulation allostérique de l'activité catalytique de la PDE6 par les domaines GAF N-terminaux et la sous-unité PDE6γ. Une comparaison de la structure du complexe PDE6αβ2γ avec la structure à l'état fermé de PDE2A montre la réorganisation des régions de boucle GAF β1-β2 qui forment des routes de transduction de signal allostérique potentielles de GAF-A au domaine catalytique par le domaine GAF-B lors de la liaison du cGMP ( Fig. 4). Ces signaux allostériques sont ensuite traduits en mouvement vers l'extérieur de la région de boucle en H qui permet la liaison et l'hydrolyse du substrat (figures 3 et 4). Les domaines régulateurs N-terminaux sont essentiels pour réguler étroitement la signalisation des nucléotides cycliques par les isoenzymes de la PDE. La famille PDE de type I comprend une variété de domaines N-terminaux, notamment des domaines de liaison calcium / calmoduline, des régions conservées en amont régulées par une protéine kinase et des domaines GAF. Cependant, la régulation allostérique de la majorité des PDE est régie par les domaines GAF N-terminaux (fig. S1). Notamment, l'activation de PDE2A est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-B, alors que l'activation de PDE5 induite par le GMPc est médiée par la liaison du GMPc au domaine GAF-A. D'autre part, l'activation de PDE6 est plus complexe et implique la liaison de Gαt-GTP, qui libère la contrainte inhibitrice de PDE6γ sur le site catalytique de PDE6 (16) et réduit l’affinité de liaison du GMPc à l’un des deux domaines GAF-A. Par conséquent, le modèle proposé affichant les modifications structurelles représentatives associées à la régulation allostérique de la PDE (figure 4B) est probablement limité aux homologues structurels étroitement apparentés de la PDE6.\nLa structure du complexe PDE6αβ2γ présente plusieurs caractéristiques en accord avec les données de reticulation chimique et de spectrométrie de masse publiées précédemment (31). Ces caractéristiques incluent une organisation en tandem des domaines GAF, une organisation parallèle des deux sous-unités catalytiques et la présence de segments hélicoïdaux juxtaposés dans l'hétérodimère PDE6αβ (31). PDE6 est le seul membre de la famille PDE de type I dont les sous-unités inhibitrices sont liées au dimère catalytique (32). Des études de réticulation antérieures ont indiqué la capacité de PDE6γ à se lier aux domaines catalytiques de l’hétérodimère PDE6αβ, ses résidus C-terminaux bloquant ainsi la poche de liaison au substrat (30). La liaison à la PDE6γ a également été proposée pour moduler la liaison du GMPc au niveau du domaine régulateur GAF-A (33). Ce contrôle allostérique interdomaine inhabituel pour un polypeptide PDE6γ de 9,7 kDa a souvent été débattu en raison du manque de preuves structurelles. Cette étude fournit la confirmation structurelle directe que PDE6γ adopte une conformation étendue et en grande partie non structurée pour permettre son interaction à la fois avec la poche de liaison au GMPc de GAF-A et le domaine catalytique de l'hétérodimère PDE6αβ. De plus, l'interaction de PDE6γ C-terminus avec les sous-unités catalytiques stabilise la conformation à l'état ouvert du complexe PDE6αβ2γ.\nGlobalement, la structure à haute résolution du complexe PDE6αβ2γ et sa comparaison avec la structure PDE2A à l'état fermé fournissent un cadre structurel solide pour la conception rationnelle de molécules candidates sélectives pour des isoenzymes de PDE spécifiques afin d'atténuer les effets secondaires induits par les approches thérapeutiques conventionnelles."},{"id":"text-11","heading":"Text","content":"MATÉRIAUX ET MÉTHODES"},{"id":"text-12","heading":"Text","content":"Purification de PDE6\nToutes les procédures expérimentales ont été effectuées dans une chambre noire sous une lumière rouge tamisée (> 670 nm). Les ROS bovines ont été préparées comme décrit ailleurs (34). Les ROS ont été dilués dans un tampon isotonique contenant Hepes 20 mM (pH 7,5), MgCl 5 mM.2, 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 100 mM de NaCl. La suspension a ensuite été centrifugée à 30 000 ° C.g à 25 ° C pendant 25 min pour éliminer les protéines solubles et certaines protéines associées à la membrane (35, 36). Le culot a été remis en suspension dans un tampon hypotonique contenant Hepes 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM et DTT 1 mM et homogénéisé doucement trois fois en faisant passer manuellement la suspension dans un homogénéisateur verre à verre. L'homogénat a été centrifugé à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C. Les surnageants des deux lavages hypotoniques ont été rassemblés et centrifugés plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant limpide a été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.2et 1 mM de DTT pendant 3 heures à 4 ° C. La solution hypotonique a été complétée par des membranes ROS (25 µM de rhodopsine) et 250 µM de GTPγS (Sigma-Aldrich), puis par une illumination de lumière pendant 30 minutes avec une lumière de fibre de 150 W (NCL-150, Volpi, États-Unis) délivrées via un filtre 480 – filtre passe-bande à 520 nm (Chroma Technology Corporation, États-Unis). La remise en suspension a ensuite été centrifugée plusieurs fois à 40 000g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer complètement tout culot de ROS résiduel. Le surnageant a été chargé sur une colonne C10 / 10 (GE Healthcare) avec 6 ml de résine propyl-agarose pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2et 1 mM DTT. Ensuite, la colonne a été lavée avec 30 volumes de résine du tampon d'équilibrage suivis de 2 volumes de résine de tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, DTT 1 mM et NaCl 50 mM. Les protéines liées ont été éluées avec 30 ml de tampon d'équilibrage contenant 0,4 M de NaCl. L'éluat a ensuite été dialyse contre un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM.21 mM EDTA et 1 mM DTT.\nL'éluat dialyse a été chargé sur une colonne C10 / 20 (GE Healthcare) avec 15 ml de résine Blue Sepharose CL-6B (Sigma-Aldrich) prééquilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM21 mM EDTA et 1 mM DTT. Le flux continu a été complété par un nanocorps qui se lie spécifiquement à Gβ1γ1 (37) pour le retirer de l'échantillon (fig. S3). Après 30 min d’incubation, Ni2+–La résine d'acide nitrilotriacétique pré-équilibrée avec Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 6 mM2On a ajouté 1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT. Après 30 min d’incubation, la résine liée à Gβ1γ1 a été éliminé en passant la remise en suspension à travers une colonne jetable de Pierce (Thermo Fisher Scientific). L'écoulement contenant Gαt et PDE6 obtenus à partir du Ni immobilisé2+ La chromatographie d'affinité a ensuite été concentrée et chargée sur une colonne Superdex 200 10/300 GL équilibrée avec un tampon contenant Hepes 10 mM (pH 7,5), MgCl 2 mM.2, 1 mM de DTT et 100 mM de NaCl (fig. S3, A et B). Les fractions contenant la PDE6 ont été combinées, concentrées à environ 0,7 mg ml−1, et utilisé pour les analyses cryo-EM. La caractérisation fonctionnelle de PDE6 a été décrite précédemment (26, 38)."},{"id":"text-13","heading":"Text","content":"Préparation d'échantillons Cryo-EM, acquisition de données et traitement de films\nTrois microlitres de PDE6αβ2γ ou PDE6αβ2γ purifié avec un excès de 5 M de sildénafil à une concentration de 0,7 mg ml−1 ont été appliqués sur une grille Quantifoil R2 / 2 400 mesh (Electron Microscopy Sciences) sans décharge luminescente préalable. Les grilles ont été congelées dans de l'éthane liquide avec du FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) dans les conditions suivantes: température de 4 ° C; humidité 100%; temps de transfert, 2 s; et force de buvard réglée à -10. Des grilles gelées ont été imagées dans un Titan Krios FEI (300 kV, Thermo Fisher Scientific) équipé d'un filtre d'énergie Gatan Quantum-LS (filtrage zéro perte à 20 eV) connecté à un détecteur Gatan K2 Summit fonctionnant en mode de comptage à super-résolution. Des séquences vidéo super-résolution de 50 images ont été acquises avec un grossissement de × 47 259 en mode nanosonde à l’aide du logiciel SerialEM (39). Une dose totale de 80 e– UNE−2 et une taille de pixel de 0,529 Å pour les pixels de super-résolution ont été utilisés lors de la collecte de données (fig. S3C). Les vidéos acquises ont été traitées pendant la session d’imagerie avec le programme Focus (40), qui comprenait (i) une application de référence de gain et un binning 2 × des programmes clip et resample_mp.exe de l’IMOD (41) et Frealign (42) les colis, respectivement; ii) correction de mouvement et pondération de la dose par MotionCor2 (43) et iii) estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) par CTFFIND4 (44). Au total, 3134 films alignés ont été utilisés pour un traitement supplémentaire à une seule particule. Les images affichant une résolution inférieure à 7 Å lors de la correction CTF ou des dérives moyennes supérieures à 2 Å par image ont été exclues de l'analyse."},{"id":"text-14","heading":"Text","content":"Traitement d'image\nLes particules micrographiques ont été sélectionnées avec le boxer EMAN2 (45) et Gautomatch (www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/). During the initial processing, 2176 particles were automatically selected from 100 preselected images with reference-free Gautomatch localization. The selected particles were inspected with the e2boxer.py script and 2D classified in Relion 2.1 (46). A few high-resolution 2D classes were low-pass–filtered to 30 Å and used as templates for Gautomatch particle selection on all aligned images. This larger dataset of particles was 2D classified in Relion 2.1, and 30 high-resolution class averages covering a broader range of views were selected as templates for another round of Gautomatch particle selection. The final particle selection resulted in a total of 197,171 particles, which were reprocessed with Relion 2.1. After seven rounds of 2D classification, a 2D class average representing the face-view of PDE6 (fig. S3D) was used to create a rotationally symmetric starting model for 3D processing. The Fourier transform of the selected projection was low-pass–filtered to 60 Å and rotated around the long axis of the class average. The created 3D Fourier volume was back-transformed to obtain the initial real-space 3D model.\nThe 2D class averages comprising 85,929 particles were subjected to three rounds of 3D classification with the 60-Å rotationally symmetric model as a reference (fig. S6A). The resulting five 3D classes were used to generate the initial map of PDE6 at a resolution of 8.2 Å, which was subjected to the e2project.py script of EMAN2 to compute 30 reprojections covering views from all directions to serve as templates for the final round of Gautomatch particle selection. The final dataset comprising 199,658 particles was processed by Relion 2.1. Five rounds of 2D classification reduced the dataset to 82,558 particles, which were subjected to three rounds of 3D classification (with seven, five, and five 3D classes, respectively) with the rotationally symmetric initial 3D model as a reference (fig. S6A). Two identical 3D classes displaying a resolution of 8.3 Å and comprising a total of 43,597 particles were combined into a single dataset. The combined dataset was then refined against one of the two 8.3-Å 3D classes, which was low-pass–filtered to 35 Å. Upon masking and modulation transfer function correction, the reconstructions reached a resolution of 4.1 Å, as measured by Fourier shell correlation (FSC) of a refinement in which two halves of the dataset were refined separately and combined only when building the final map (fig. S6A). The same dataset was then reprocessed with the cisTEM program (47) that uses per-particle CTF refinement and B-factor particle weighting. The final 3D reconstruction reached a resolution of 3.4 Å at an FSC of 0.143 (fig. S6B) (48). Local resolution distribution of the final map was determined by ResMap (49). The data acquisition and processing of PDE6αβ2γ treated with sildenafil was done under identical conditions as the untreated PDE6αβ2γ holoenzyme. In total, 4780 images were acquired, from which 223,656 particles were isolated and subjected to 2D classification."},{"id":"text-15","heading":"Text","content":"Model building and refinement\nThe cryo-EM map was put into an artificial crystal lattice to calculate its structure factor using the phenix.map_to_structure_factors script in the PHENIX program (50). The 3D density map was sharpened by applying a negative B-factor of −148 Å2 as determined with the phenix.auto_sharpen script (50) and by manual intervention. De novo modeling of PDE6α, PDE6β, and PDE6γ subunits was performed in Coot 0.8.8 (51) using secondary structure predictions calculated by PSIPRED (52). The densities of bulky side chains were used as references during the backbone tracing. A partial PDE6 model (PDE6α, 10 to 822; PDE6β, 11 to 822; and PDE6γ 1 to 30 and 70 to 87) was used for rigid body fitting into the 3D density map with Chimera (53). The model was then refined by rigid body refinement of individual chains in the PHENIX program (50), where the amplitudes and phases of the structural factors were used as pseudo-experimental diffraction data for model refinement. Initial models were improved by multiple rounds of PHENIX real-space refinement (50) and REFMAC version 5.8 (54) refinement against the overall map at a resolution of 3.4 Å. Each round of refinement was followed by manual model building and adjustments with Coot 0.8.8 (51). Simultaneous optimization of the stereochemical and molecular clashes was performed during the refinements, resulting in a final model to map a cross-correlation coefficient of 0.79 (fig. S6C).\nThe stereochemical quality of the final PDE6αβ2γ complex model was assessed with the Molprobity server (55). The final PDE6αβ2γ model was cross-validated with previously available crystal structures of GAF-A (27, 28), GAF-B (27, 56), and catalytic (29, 30) domains of PDE family members. Details of the cryo-EM data collection and structural refinement statistics are provided in table S1. Protein coordinates and the EM map were deposited in the Protein Data Bank (PDB) (PDB accession number: 6MZB and Electron Microscopy Data Bank ID: EMD-9297). The raw image data have been deposited in the Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) database (www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/; access number: EMPIAR-10228). All structural and density representations were generated using either Chimera (53) or Pymol (www.pymol.org)."},{"id":"text-16","heading":"Text","content":"SUPPLEMENTARY MATERIALS"},{"id":"text-17","heading":"Text","content":"Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/2/eaav4322/DC1\nFig. S1. Domain organization in the type I phosphodiesterase superfamily.\nFig. S2. Domain organization and primary sequence comparison between PDE6α and PDE6β subunits.\nFig. S3. Biochemical characterization and cryo-EM of the PD6αβ2γ complex.\nFig. S4. Structural features of regulatory GAF domains of the PDE6αβ2γ complex.\nFig. S5. Comparison between the H-loop orientations of PDE6 and PDE5.\nFig. S6. Cryo-EM reconstruction and data fitting of the PDE6αβ2γ complex.\nTable S1. Cryo-EM data collection, refinement, and validation statistics for the PDE6αβ2γ complex."},{"id":"text-18","heading":"Text","content":"This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is ne pas for commercial advantage and provided the original work is properly cited."},{"id":"text-19","heading":"Text","content":"Acknowledgments: We thank A. Sears, R. Zimmerman, and other members of the Palczewski laboratory for their helpful comments regarding this manuscript and J. Thorne-Wallis from C-CINA for assistance with the preparation of cryo-EM grids. K.P. is the Leopold Chair of Ophthalmology. Funding: This research was supported in part by grants from the National Institutes of Health (NIH) (R24EY024864 and R01EY027283 to K.P.) and Research to Prevent Blindness (RPB) to The Department of Ophthalmology at UCI, the Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR), Alcon Research Institute (ARI), and the Swiss Commission for Technology, and Innovation (CTI) grant 18272.1 PFLS-LS (H.S.). Author contributions: S.G. and K.P. designed the research and wrote the paper. S.G. performed the protein purifications and optimizations. S.G. prepared PDE6 samples for cryo-EM specimen preparation. S.G., L.K., and H.S. performed the cryo-EM work. L.K. did the cryo-EM data processing and contributed to the written paper. S.G. carried out de novo model building and refinement and analyzed the structure of the PDE6αβ2γ complex. A.E. made intellectual contributions to the study and contributed to the written paper. All authors reviewed and edited the manuscript. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data supporting the findings of this study are available within this paper. Additional data supporting the findings of this manuscript are available from the corresponding authors upon reasonable request. The cryo-EM map of PDE6αβ2γ complex has been deposited in the Electron Microscopy Data Bank under accession code EMD-9297. The modeled structure of the PDE6αβ2γ complex has been deposited at the PDB under accession code 6MZB. The cryo-EM movie files have been deposited at the EMPIAR under accession code EMPIAR-10228."},{"id":"text-20","heading":"Text","content":"Copyright © 2019 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC)."},{"id":"text-21","heading":"Text","content":"Click to rate this post!\n \n [Total: 0 Average: 0]"}],"media":{"primary_image":"https://tutos-gameserver.fr/wp-content/uploads/2019/05/F1.medium.gif"},"relations":[{"rel":"canonical","href":"https://tutos-gameserver.fr/2019/05/04/la-structure-cryo-em-de-la-phosphodiesterase-6-revele-un-eclairage-sur-la-regulation-allosterique-des-phosphodiesterases-de-type-i-bien-choisir-son-serveur-d-impression/"},{"rel":"alternate","href":"https://tutos-gameserver.fr/2019/05/04/la-structure-cryo-em-de-la-phosphodiesterase-6-revele-un-eclairage-sur-la-regulation-allosterique-des-phosphodiesterases-de-type-i-bien-choisir-son-serveur-d-impression/llm","type":"text/html"},{"rel":"alternate","href":"https://tutos-gameserver.fr/2019/05/04/la-structure-cryo-em-de-la-phosphodiesterase-6-revele-un-eclairage-sur-la-regulation-allosterique-des-phosphodiesterases-de-type-i-bien-choisir-son-serveur-d-impression/llm.json","type":"application/json"},{"rel":"llm-manifest","href":"https://tutos-gameserver.fr/llm-endpoints-manifest.json","type":"application/json"}],"http_headers":{"X-LLM-Friendly":"1","X-LLM-Schema":"1.1.0","Content-Security-Policy":"default-src 'none'; img-src * data:; style-src 'unsafe-inline'"},"license":"CC BY-ND 4.0","attribution_required":true,"allow_cors":false}